神经生长因子在大鼠睾丸中的表达研究

应用免疫组织化学SP法研究了神经生长因子在大鼠睾丸中的表达。研究发现:神经生长因子主要分布在睾丸的间质细胞和肌样细胞。大鼠睾丸神经生长因子免疫反应产物在4周龄为强阳性,23周龄为中等阳性,50周龄为弱阳性。结果还表明:随大鼠的年龄增大,神经生长因子在睾丸中的表达逐渐减少。     

仔猪睾丸组织块生精细胞体外培养及鉴定初报

目的：建立仔猪睾丸组织块生精细胞爬片体外培养模型。方法：应用溴脱氧核苷尿嘧啶(5＇-Bromo-2＇-deoxyuridine, BrdU)免疫荧光技术检测生精细胞体外增殖分化情况；采用HE染色鉴定体外培养生精细胞分化程度。结果：结果表明体外培养第3天支持细胞开始游出睾丸组织块并贴壁；体外培养第4～8天睾丸组织块周围可见生精细胞，但未见明显增殖分化情况；体外培养第9～20天可明显观察到生精细胞增殖分化，间桥连接(gap junction)的生精细胞集落呈葡萄串或串珠状，并有精子细胞形成。结论：本培养体系能够提供睾丸组织块生精细胞增殖分化所需要的条件，在没有添加睾酮的情况下能够使非精子细胞分化为精子细胞。     

小鼠精原细胞体外存活、增殖特性及冷冻保存研究

为研究小鼠精原细胞体外存活、增殖特性及其以单细胞或处于功能性结构中(曲细精管或完整睾丸)耐受冷冻-解冻程序的能力。本研究收集生后7d昆白系小鼠睾丸，一步酶法分离获得生精上皮单细胞悬液(主要含精原细胞和支持细胞)，分别接种于D-MEM、D-MEM/F12、KSOM（均含10%的FBS）后系统观察了精原细胞的存活和增殖情况；对生精上皮单细胞进行了-70℃冷冻保存和液氮冷冻保存，对曲细精管及完整睾丸进行了-70℃冷冻保存。结果显示，D-MEM和D-MEM/F12均能使小鼠精原细胞存活和增殖，精原细胞分别在培养的第1~9d或第1~8d 呈逐渐减少趋势，第9~13d或第8~12d呈增殖趋势，而第17d或第16d以后增殖减缓，KSOM只能使小鼠精原细胞短暂存活而不能使其增殖。精原细胞单独培养时增殖不明显而逐渐呈现出分化迹象。生精上皮单细胞、曲细精管及完整睾丸-70℃短期(1wk和2wk)冷冻保存或单细胞悬液液氮短期(2wk)和中长期(1个月和3个月)冷冻保存后均可以获得较理想的细胞存活率(均大于85%)。     

小鼠精原细胞体外增殖与冷冻保存

利用一步酶法将7日龄昆白系小鼠睾丸分离获得生精上皮单细胞悬液(主要含精原细胞和支持细胞),分别接种于D-MEM、D-MEM/F12和KSOM后,系统研究其精原细胞的存活和增殖情况,并对生精上皮单细胞、曲细精管及完整睾丸进行了-70℃冷冻保存,同时对生精上皮单细胞进行了液氮冷冻(-196℃)保存。结果表明,小鼠精原细胞在D-MEM和D-MEM/F12中均能存活并增殖,表现为在培养的第1～9天/1～8天呈逐渐减少趋势,第9～13天/8～12天呈增殖趋势,第17天/16天以后增殖减缓,而在KSOM中只短暂存活不能增殖。生精上皮单细胞、曲细精管及完整睾丸-70℃短期(1周和2周)冷冻保存及单细胞悬液液氮短期(2周)和中长期(1和3个月)冷冻保存后,均可获得较理想的细胞存活率(均大于85%)。     

仔猪睾丸支持细胞的增殖与发育

为了阐明支持细胞增殖和分化能力对精子生成的影响,本实验以7、21和35d仔猪为材料,利用细胞直接计数、免疫组织化学、流式细胞术和免疫印迹分析了仔猪睾丸支持细胞、生精细胞数量和增殖能力变化以及支持细胞的成熟分化状况。结果:(1)从7～21d,曲细精管中支持细胞与其它细胞之间的界线更加明显;从7～35d,每克睾丸中间质细胞和支持细胞的数量在21d时达到高峰(P<0.05),而生精细胞的数量则一直增加(P<0.05),但并没有在曲细精管中发现圆形精子;(2)从7～35d,支持细胞和间质细胞都能表达GATA-4,支持细胞中GATA-4的累积光密度(IOD)在21d时最高(P<0.05),而间质细胞中的IOD在21d和35d之间没有明显差异(P>0.05);(3)从7～35d,整个睾丸细胞都有增殖能力,睾丸细胞的细胞增殖指数(PI)和S期细胞指数(SPF)在21d时最高(P<0.05);三种细胞在这一时期都能表达PCNA,三种细胞PCNA的IOD值和睾丸中PCNA的表达水平在21d时最高(P<0.05);(4)从7～35d,Connexin 43(Cx43)主要表达于支持细胞的细胞质,支持细胞和间质细胞中的IODs在2...     

BRL饲细胞及血清浓度对体外小鼠精原干细胞的影响

分别以大鼠肝细胞(BRL)或小鼠胚胎成纤维细胞(STO)为饲养层．采用含5％、10％及20％胎牛血清的培养液，培养6日龄小鼠生精上皮细胞，研究饲养层和血清浓度对精原干细胞生物学行为的影响。结果表明：在培养的第1周内，2个及4个连成串的精原细胞合胞体数量明显增加，同时大多数精原细胞逐渐退化。培养1周后，大多数精原细胞经短暂的存活及分裂活动后退化消失，培养体系中仅保留下少量单个及由细胞间桥相连的双个及4个成串或成团的A型精原细胞。这些细胞在随后的培养过程中，不表现明显的分裂活动，呈圆球形，表达碱性磷酸酶。不同条件培养体系中的精原细胞及精原干细胞的生物学行为无明显不同，培养20～30d时均有少量精原干细胞存活。这说明BRL细胞能用作饲养层促进精原干细胞存活，但对其更新性增殖没有明显作用；培养液中高浓度胎牛血清对精原干细胞存活和增殖无明显影响，但能促进睾丸体细胞增殖。     

Dazl基因在绵羊不同发育期睾丸组织中的表达与细胞定位

类无精症缺失基因(deleted in azoospermia-like gene,Dazl)在雄性动物生殖细胞分化过程中起重要调控作用,但对于不同物种或处于不同发育阶段的同一物种而言,其调控机制存在差异。为了探讨Dazl在绵羊(Ovis aries)不同发育期睾丸组织中的表达、定位及调控作用,本实验选取0、2、5、12和24月龄健康的绵羊15只,每组3只,采取睾丸、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉组织。运用实时荧光定量PCR(quantitative Real time PCR,q RT-PCR)检测了0、2、5、12和24月龄绵羊睾丸组织及12月龄绵羊的不同体组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉)中Dazl m RNA的表达量,利用Western blot技术对Dazl基因编码蛋白的表达量进行检测,并采用免疫组织化学染色方法检测Dazl蛋白的阳性信号在不同月龄睾丸组织中的分布情况。结果显示,对于不同月龄睾丸组织,从m RNA和蛋白水平均检测到了Dazl基因的表达,并且二者的趋势基本相似。在0、2和5月龄睾丸中Dazl m RNA及蛋白表达量较低,12月龄中表达量较高且极显著高于0、2和5月龄(P0.01),而在24月龄中Dazl m RNA及蛋白的表达量均出现不同程度的下调现象。12月龄绵羊各组织的q RT-PCR检测结果显示,Dazl m RNA只在睾丸组织中高表达,在心脏中表达量很低,而在其他组织中不表达。免疫组织化学染色结果显示,Dazl蛋白在初情期前(0、2和5月龄)定位于睾丸间质细胞,而在12和24月龄定位于睾丸间质细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞。研究结果表明,Dazl基因在性成熟前公羊的睾丸间质细胞及成年羊的睾丸间质细胞、精母细胞和精细胞中表达,并且在他们的增殖过程中起调控作用。由此推测,在绵羊睾丸发育过程中,Dazl基因可能通过直接作用(调控精母细胞的成熟分裂)和间接作用(调控睾丸间质细胞的增殖)共同调控精子发生。本研究为进一步研究Dazl基因在雄性动物精子发生过程中的调控机制提供了科学依据和参考。     

SOX9基因在绵羊不同组织中的表达及其在睾丸中的定位

SRY-盒包含蛋白9(sex determining region Y-box 9,SOX9)基因在哺乳动物个体发育中扮演重要角色,广泛存在于各种组织,但主要在睾丸组织表达,参与调控睾丸细胞的增殖与分化.本研究采用qRT-PCR方法检测了6月龄小尾寒羊(Ovis aries)体组织及其0、2、6、12和24月龄睾丸组织SOX9mRNA的表达规律,并运用Western blot、免疫组织化学技术对不同发育期睾丸SOX9蛋白进行表达与定位研究.结果显示,在体组织中SOX9 mRNA表达无组织特异性,但垂体表达量最高,下丘脑和睾丸次之,肌肉组织9背最长肌和股二头肌)几乎无表达;随着月龄的增加,SOX9 mRNA在睾丸中的表达量先降低后上升,其中6月龄睾丸表达量显著高于0和2月龄(P＜0.05),但显著低于12和24月龄(P＜0.05).SOX9蛋白表达趋势与mRNA基本一致,0、2和6月龄睾丸中表达较低,少量支持细胞和间质细胞呈免疫阳性反应;12和24月龄睾丸中表达较高且呈增加趋势,支持细胞、部分间质细胞、极少量初级精母细胞和次级精母细胞呈免疫阳性反应.研究结果表明,SOX9基因在绵羊不同体组织中广泛表达,在下丘脑-垂体-睾丸生殖轴中发挥重要作用,并与睾丸细胞的增殖及分化过程有密切的关系.     

胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在不同年龄公猪睾丸中的表达

采用免疫组化（immunohistochemistry）和半定量RT-PCR法研究了胶质细胞源性神经营养因子（Glial cellline-derivedneurotrophic factor,GDNF）在生后仔猪睾丸中的表达,探讨了GDNF在睾丸发育和精子发生中的作用.实验结果发现,在幼龄阶段（2～4周龄）,GDNF蛋白主要表达于间质细胞区,而在曲细精管内未见表达.从第2月龄开始,GDNF蛋白在曲细精管内的支持细胞胞浆出现阳性信号,呈较低水平表达.随着年龄的进一步增长,GDNF在睾丸曲细精管内的表达不断增强,到成年时GDNF蛋白表达水平达最高.RT-PCR结果显示,仔猪出生后2周,睾丸中即存在GDNFmRNA的表达,随着年龄的增加,GDNFmRNA水平持续升高,到2月龄和6、18月龄分别与出生2周时有显著性（P＜0.05）和极显著性（P＜0.01）差异,其中第6月龄达高峰.实验结果表明GDNF可能直接参与了出生后仔猪睾丸的发育,并在调节精子发生中起着重要的作用.     

HSP60对天祝白牦牛原代培养的支持细胞增殖的影响

HSP60对动物的睾丸发育、精子发生起着重要的调控作用。支持细胞是睾丸内唯一与生精细胞直接发生联系的体细胞,对精子发生、成熟等过程有直接影响。为研究HSP60对白牦牛睾丸支持细胞增殖的调控作用,本试验通过组合酶消化法分离培养白牦牛原代支持细胞,通过差速贴壁法和Tris-HCL低渗缓冲液进行纯化处理,运用免疫荧光染色和Feulgen染色鉴定细胞,经流式细胞仪检测得到96.2%高纯度支持细胞。构建HSP60过表达载体p IRES2-EGFP-HSP60,合成靶向siRNA沉默HSP60,瞬时转染支持细胞后,经qPCR检测发现过表达组HSP60 mRNA在24、48、72 h等时间点均上调,沉默组HSP60 mRNA在24、48、72 h等时间点均下调。MTS试验检测细胞的增殖情况,过表达HSP60组中的支持细胞增殖效率各时间点均显著高于空白对照组和空质粒组;沉默HSP60组中支持细胞的增值率各时间点均低于空白对照组和阴性对照组,但差异不显著。qPCR检测细胞增殖标志基因细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和增殖细胞核抗原(PCNA),结果表明,过表达HSP60组的cyclin D1基因在48 h时的表达显著高于空白对照组和空质粒组,PCNA基因的表达在24、48、72 h时均显著高于空白对照组和空质粒组;沉默HSP60组cyclin D1基因和PCNA基因的表达在24、48、72 h时均低于空白对照组和阴性对照组,但差异不显著。综上,HSP60在白牦牛睾丸支持细胞增殖调控中的作用是正向调控。本试验结果为进一步研究HSP60对白牦牛睾丸发育和精子发生的影响奠定了理论基础。     

山羊胎儿睾丸细胞体外分离培养及雄性生殖系干细胞的生长行为

摘要：采用4种不同的处理方法消化山羊胎儿睾丸组织，其中0.1%的胶原酶Ⅰ处理15 min后， 用0.25%胰酶处理5 min，经3次洗涤，睾丸细胞分散较好。用不同的培养体系体外培养，结果显示：原代培养山羊胎儿睾丸细胞培养120 h左右，获得桑椹状雄性生殖系干细胞(mGSCs)集落和单层支持细胞，mGSCs集落呈半悬浮式隆突生长，mGSCs集落和支持细胞分区明显；传代培养显示，在小鼠成纤维细胞饲养层上， mGSCs集落和mGSC单细胞被同质化程度较显著，而含有支持细胞的mGSC单细胞和mGSCs集落被同质化程度较弱；传代mGSCs集落和支持细胞共培养体系中，mGSCs集落正常生长，而且集落中细胞间隙紧密，mGSCs分化较慢。     

精原干细胞的研究进展

精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）指位于曲精细管基膜上的一类原始精原细胞,近年来因其在生产转基因动物方面有广阔的应用前景,受到了极大的关注。在胚胎发育前期,一小部分细胞分化形成原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）,并迁移至生殖嵴,PGCs随后增殖分化形成生殖母细胞并迁移至睾丸基底膜,随着雄性动物出生,生殖母细胞迁移至细精管并转化成SSCs。本文概述了近年来SSCs的研究进展,主要包括SSCs的分离、鉴定、体外培养体系以及SSCs诱导精子。此外,本文重点阐述了SSCs的研究前景。     

培养的睾丸间质细胞对hCG刺激的反应性

本文介绍了用酶解法结合差速离心分离仔猪睾丸间质细胞,并研究其对促性腺激素的反应性。结果表明在0～50IUml内,睾酮的分泌量随着hCG剂量的增加而增加,在50IUml～100IUml内,加大hCG剂量并不能增强间质细胞的分泌功能。研究还发现随着培养时间的延长,间质细胞分泌睾酮的功能逐渐减低,培养1d和2d时对hCG(人绒毛膜促性腺激素)刺激的反应能力最强;随着培养时间的进一步延长,间质细胞的反应性下降,4d时与对照无明显差异(P>0.05)。间质细胞对首次刺激的反应敏感,当连续给予刺激时,睾酮的分泌受到抑制,在24h的分泌峰后不再出现分泌高峰。而首次刺激后间隔2d再刺激,间质细胞虽有反应,但反应较弱。     

天祝白牦牛HSP60基因的克隆及其在下丘脑-垂体-睾丸中的表达定位研究

热休克蛋白60(HSP60)不仅在细胞保护方面发挥作用,也参与雄性动物生殖生理的调控。为研究HSP60基因序列特性及其在天祝白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴(HPT-axis)上的表达情况,探寻其在白牦牛睾丸发育、精子发生过程中的作用机制,本研究采用RT-PCR和RACE技术获得白牦牛HSP60基因全长cDNA序列,采用生物信息学方法分析HSP60蛋白的理化性质、结构及不同物种之间的同源性等,并利用qPCR、Western blotting、免疫组化法分析HSP60在白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴中的表达及定位。结果表明,白牦牛HSP60基因cDNA全长为2 300 bp,开放阅读框为1 722 bp,编码572个氨基酸;其理论分子量为60.977k Da、等电点为5.69,编码的蛋白为非跨膜可溶性蛋白。氨基酸序列比对结果显示,白牦牛HSP60氨基酸序列与牛、瘤牛、绵羊、藏羚羊、骆驼、白犀牛、兔和黑猩猩的氨基酸序列同源性高、进化水平相近。HSP60基因及蛋白在白牦牛的下丘脑、垂体及睾丸组织中均有表达,其中下丘脑及垂体组织表达量显著高于睾丸,下丘脑和垂体之间差异不显著。免疫组化结果显示,HSP60蛋白定位表达于白牦牛下丘脑组织的室旁核大细胞、室旁核小细胞和神经角演网、垂体组织的腺细胞、睾丸组织的精原细胞、精母细胞、支持细胞和间质细胞,而精子细胞中表达较弱。通过对健康成年白牦牛HSP60在下丘脑-垂体-睾丸轴的表达与定位检测,推断HSP60参与雄性白牦牛生殖轴调控,并参与睾丸发育与精子发生。本研究结果为进一步研究HSP60对雄性生殖调控奠定了基础。     

土壤溶液动态变化和CdCO3, CdS的平衡研究

土壤渍水后带来了一系列的电化学和化学变化,pH、氧化还原电位(Eh)、电导(EC)、离子交换、吸附和解吸、化学动力学和化学平衡等都有着显著的改变^[9,11,13],它们影响着土壤肥力状况和植物对毒性元素的吸收。本文报道了在添加Cd,P,Zn化合物的情况下土壤溶液动态变化和CdCO₃,CdS平衡研究的结果。