广西本地水牛垂体的形态学与组织学观察

本研究采用HE染色和Masson特殊染色方法对广西本地水牛垂体的形态学和组织学结构特征进行了观察分析,结果表明:广西本地水牛垂体呈卵圆形,重约1.19g,大小约为1.43cm×1.07cm×0.74cm。广西本地水牛的神经部在正中矢状面所占比例约为10%～15%。嗜酸性细胞、嗜碱性细胞的比例分别为42%和9.3%;母牛的嗜酸性细胞比例比公牛的高。观察结果揭示广西本地水牛垂体的结构与形态特征与其长期繁衍进化所处生态环境变化相适应,并与其生长、生产规律相一致。这些结果将为改良广西本地水牛提供形态学和组织学的理论依据。     

水牛输卵管上皮细胞无血清培养的研究

以广西沼泽型水牛（Bubalus bubalis）输卵管为材料，比较研究不同取材方法、有无血清及生长因子对水牛输卵管上皮细胞培养的影响。试验采用了三种不同的取材方法。原代用含血清的培养液来培养，传代用添加生长因子的无血清复杂培养液和不添加生长因子的无血清基础培养液结合梯度减量无血清培养法和直接无血清培养法来培养并进行观察。结果表明，水牛输卵管上皮细胞可以在添加生长因子的无血清复杂培养液中生长、并且最长可维持56d优于基础无血清培养的15d；刮取法获得的细胞活率为95％优于消化法的70％和剪碎法的83％；细胞冷冻复苏率为83．6％；第5代的染色体数目为48条，这说明细胞依然保持正常的生物学特性和二倍体核型。     

广西沼泽型水牛γ-干扰素基因的克隆与原核表达

本研究克隆了广西沼泽型水牛γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)基因,并构建了水牛IFN-γ原核表达质粒。从健康沼泽型水牛静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用刀豆素A(Concanavalin A,ConA)诱导培养13 h后,提取细胞总RNA,用水牛IFN-γ基因特异性引物通过RT-PCR扩增水牛IFN-γ成熟肽编码区cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中。RT-PCR产物电泳可见约457 bp大小目的片段。经过限制性酶切分析,测序证实克隆得到的基因序列正确。将IFN-γ成熟肽编码区基因片段切下亚克隆到表达载体pET-32a 中,构建成重组表达质粒pET-mIFN-γ。PCR、双酶切电泳和序列测定结果均证实已插入约457 bp的IFN-γ基因片段。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,水牛IFN-γ基因在大肠杆菌中获得了高效的表达,融合蛋白的分子量为35 ku,表达量占菌体总蛋白的43.6%。     

微卫星标记分析广西水牛遗传多样性

为研究广西沼泽型水牛(Bubalus bubalis)核基因组的多态性,采用23对荧光标记微卫星引物,对随机抽取的60个广西本地水牛样本进行了PCR检测。结果表明,23对引物中,有19对可以获得特异性产物且存在多态,平均有效等位基因数为4.0189,基因座ILSTS086含有13个等位基因;各微卫星基因座的平均杂合度变化范围为0.1852~0.4722,ILSTS019基因座平均杂合度最高(0.4722),而ILSTS017平均杂合度最低(0.1852);群体基因平均多态信息含量(PIC)为0.6639,19个标记中有18个PIC大于0.5,属高度多态位点。     

绵羊和水牛实验感染大片吸虫后外周血白细胞计数的分析

对绵羊和水牛在感染大片吸虫后外周血白细胞总数计数和白细胞分类计数(嗜酸性细胞、嗜中性细胞、嗜碱性细胞、淋巴细胞和单核细胞)的特性进行研究。结果表明,绵羊对大片吸虫很不易感,水牛对大片吸虫很易感。未感染绵羊和水牛的白细胞总数有较大的差距,分别为5 956(±825)个细胞/mm3血液和12 657(±1 053)个细胞/mm3血液。未感染绵羊和水牛的嗜酸性细胞占白细胞总数的百分比小于5%。淋巴细胞占的比例最大,绵羊为59.5%,水牛达70.8%。感染绵羊和未感染绵羊的白细胞总数、嗜酸性细胞计数在感染过程中总体上存在显著差异,感染后绵羊的嗜酸性细胞的数量迅速升高,在感染后4周(4W P I)达到高峰。而感染水牛和未感染水牛白细胞总数差异不显著,但嗜酸性细胞存在显著差异,感染后水牛的嗜酸性细胞的数量升高缓慢,到8 W P I达到高峰。结果提示嗜酸性细胞在感染绵羊中更加有效地参与了杀灭大片吸虫。     

奶水牛体型线性性状与其第一胎305 d产奶量的相关与通径分析

对广西水牛研究所共84头奶水牛的体型线性性状与其第一胎305 d产奶量进行相关与通径分析。结果显示:奶水牛体型线性性状中,尻长与摩拉水牛、尼里-拉菲水牛、三品杂水牛等三个品种奶水牛的第一胎305 d产奶量均有较强的相关,分别是0.3141、0.3343和-0.2184;此外,摩拉水牛的体高(-0.3410),尼里-拉菲水牛的后房高(0.3847)、后房宽(0.4750),三品杂水牛的后房高(-0.2852)、乳房深(0.2662)与其对应的第一胎305 d产奶量有较强的相关。结果表明:奶水牛体型线性性状与其第一胎305 d产奶量存在一定的相关,但其影响在不同品种间有很大的差异;结果也可能表明对奶水牛体型线性性状的选择标准和要求不同于普通奶牛。     

水牛催乳素受体基因克隆及序列分析

扩增出广西本地沼泽型水牛（Bubalus bubalis）催乳素受体（PRLR）基因部分保守序列,用于下一步实验检测体外培养的水牛乳腺上皮细胞中催乳素受体基因的表达水平。根据已报道的奶牛催乳素受体基因cDNA序列的保守区,设计一对特异性引物。提取广西本地水牛的乳腺组织总RNA,并以其为模板,以下游特异性引物为反转录引物,在反转录酶（AMV）作用下合成cDNA;用Ex-Taq酶进行PCR扩增,得到催乳素受体基因的保守序列,长度为571bp。该扩增产物经纯化后,连接到pMD18-T载体上扩增。经序列分析结果表明：序列较保守,与GenBank上发表的奶牛催乳素受体基因的同源性达到98．9％,与绵羊的同源性达到96．5％,与猪、小鼠、人的同源性分别为86．5％、78．9%、77．1％。催乳素受体基因与奶牛相比,共有6个碱基发生了突变,其中1个为同义突变,其他5个均为错义突变,形成4个氨基酸发生变异。     

世界首例性别控制水牛在广西诞生

2006年2月13日上午11时20分,一头杂交母水牛在广西南宁顺利地产下了经分离XY精子性别控制的雌性试管水牛双犊,这在世界上尚属首例。分离水牛XY精子的性别控制研究项目由广西大学动物繁殖研究所所长、博士生导师卢克焕教授主持,广西水牛研究所和广西畜禽品种改良站共同参与完成。该项目获得了国家自然科学基金、广西区人民政府主席基金和区科技厅科技攻关项目资金联合资助。这两头性别控制试管水牛犊体重均为29 kg。“姊妹花”的出生经历了复杂、严密的科学设计:首先是用流式细胞仪分离出良种摩拉水牛精液的X精子和Y精子,然后将X精子与本…     

胰岛素和葡萄糖对水牛体外受精早期胚胎发育的影响

探讨了不同浓度的胰岛素和葡萄糖对水牛体外受精早期胚胎体外发育的影响。结果表明,添加胰岛素浓度为5μg/mL时,水牛早期胚胎的囊胚发育率、囊胚细胞数及冷冻-解冻后胚胎的孵化率都显著高于对照组及其他浓度组(P<0.05);加入葡萄糖的浓度大于6 mm o l/L时显著影响水牛早期胚胎发育到囊胚及孵化囊胚的阶段(P<0.05);联合添加胰岛素和葡萄糖时能显著提高水牛早期胚胎的孵化囊胚率、总囊胚率和囊胚细胞数(P<0.05)。实验证实,浓度为5μg/mL胰岛素能促进水牛体外受精早期胚胎的发育;在TCM-199中单独添加葡萄糖是不必要的,联合添加葡萄糖和胰岛素能促进水牛体外受精早期胚胎的发育。     

供体细胞处理方法对水牛核移植效果的影响

本研究探讨了水牛供体细胞不同培养处理方法对细胞周期及其核移植效果的影响。流式细胞仪分析供体细胞周期的结果显示,水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞,在增长期、汇合长满期或经血清饥饿培养或0.1μg/mL蚜栖菌素(APD) 0.5%胎牛血清(FBS)培养处理后,G0 G1期细胞比率差异显著(P<0.05),其中以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理的G0 G1期细胞比率最高(87.89%和89.04%);而增长期的G 2 M期的细胞比率以及汇合长满期的S期细胞比率明显高于其他三组,但经血清饥饿处理后,DNA碎片明显高于其他三组(P<0.05)。当分别以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理后的水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞作供核时,重组胚的卵裂率及囊胚发育率,均显著高于血清饥饿处理或汇合长满期的同种供体细胞(成纤维细胞:70.14%vs 58.29%和55.90%,21.33%vs 10.55%和8.72%;颗粒细胞:74.35%vs 60.51%和57.61%,22.17%vs10.26%和9.78%,P<0.05),但汇合长满期或血清饥饿处理的供体细胞构建的重组胚,其卵裂率和囊胚率均没有显著差异(P>0.05)。将经APD处理后的供体细胞构建核移植胚胎,移植给受体水牛后有1头受体水牛妊娠并成功的产下后代。以上结果表明:0.1μg/mL APD 0.5?S预培养处理供体细胞,能有效的抑制细胞停留在G0/G1期,并能提高其核移植胚胎的发育率,而且已成功的获得后代。但在本培养系统中,血清饥饿处理供核细胞是没有必要的。     

Cloning and expression of buffalo active chymosin in Pichia pastoris

To date, only recombinant chymosin has been obtained in its active form from supernatants of filamentous fungi, which are not as good candidates as yeasts for large-scale fermentations. Since Bos taurus chymosin was cloned and expressed, the world demand for this protease has increased to such an extent that the cheesemaking industry has been looking for novel sources of chymosin. In this sense because buffalo chymosin has properties that are more stable than those of B. taurus chymosin, it may occupy a space of its own in the chymosin market. The main objective of the present work was the production of active recombinant buffalo chymosin in the culture supernatant of Pichia pastoris . This yeast has demonstrated its usefulness as an excellent large-scale fermentation tool for the secretion of recombinant foreign proteins. RNA was extracted from the abomasum of a suckling calf water buffalo ( Bubalus arnee bubalis ). Preprochymosin, prochymosin, and chymosin DNA sequences were isolated and expressed into P. pastoris. Only the recombinant clones of P. pastoris containing the prochymosin sequence gene were able to secrete the active form of the chymosin to the culture supernatant. This paper describes for the first time the production of active recombinant chymosin in P. pastoris without the need of a previous in vitro activation. The new recombinant yeast strain could represent a novel and excellent source of rennet for the cheesemaking industry.     

核转染技术转染水牛细胞的初步研究

本研究旨在获得一种高效转染水牛细胞的方法。本研究首先以水牛胎儿成纤维细胞（BFF）为研究对象,建立、优化核转染法;随后,比较核转染法、脂质体法、电穿孔法转染BFF的效率;最后选用较优的方法,探讨转染水牛原代骨髓间充质干细胞和类胚胎干细胞的可行性。结果发现随电压的增加,核转染BFF的效率升高;核转染电压为225V,脉冲时间为10ms时,细胞EGFP阳性率为（83.1±1.4）%,转染效率显著高于脂质体法（（11.7±1.2）%）和电穿孔法（（35.5±2.0）%）。运用优化的核转染条件可以成功将外源基因导入水牛原代骨髓间充质干细胞和类胚胎干细胞,且不影响其细胞生物学特性。本研究为以多能干细胞介导的水牛转基因克隆胚胎的生产奠定了基础。     

高产、优质、多抗晚籼杂交稻新组合博优679选育与应用

用适应性强的本地(合浦)野生稻和IR 2061、IR 661等育种材料,通过单交、复交,多世代、多株系的系谱选育,选育成一系列优良株系。用博A等不育系对所选育出的优良株系进行测交,其中第679株系与博A配组最好,定名为博优679。该组合于2003年和2004年参加广西区试和生产试验,增产显著,米质优,抗性好;2005年1月通过广西农作物品种审定委员会审定,并被指定为广西主导品种之一,现正在广西、广东、海南等地大面积推广。     

Real-time TaqMan polymerase chain reaction detection and quantification of cow DNA in pure water buffalo mozzarella cheese: method validation and its application on commercial samples

Mozzarella cheese obtained from buffalo (Bubalus bubalis) milk is a typical Italian product certificated by means of the European Protected Designation of Origin (PDO). Mozzarella cheese can also be obtained from bovine milk or bovine/buffalo milk mixtures, but in this case, it cannot be sold as PDO product, and its label must report the actual ingredients. However, bovine milk in PDO products was frequently detected in the past, suggesting fraudulent addition or accidental contamination. Several methods based on end-point polymerase chain reaction (PCR) have been profitably applied in a large number of tests to detect the presence of undeclared ingredients, also in dairy products. In the present study we report a real-time PCR method able to quantify bovine milk addition to pure buffalo cheese products. We validated a normalized procedure based on two targets: bovine mitochondrial cytochrome b (cyt b) to detect and quantify the bovine DNA and nuclear growth hormone (GH) gene used as a universal reference marker. With the use of this real-time PCR assay, 64 commercial mozzarella di bufala cheese samples purchased at local supermarkets, dairy shops, or directly from cheese manufacturers were analyzed. The results obtained demonstrate that most of the commercial samples were contaminated with bovine milk. Therefore, this assay could be conveniently employed to carry out routine and accurate controls aimed not only to discourage any fraudulent behavior but also to reduce risks for consumer health.     

水牛和黄牛种间体外受精的研究

将从屠宰母牛卵巢上采集的水牛和黄牛的卵母细胞经 2 0～ 2 4 h体外成熟培养后 ,分别用么拉水牛或奶牛精液进行种间和种内体外受精。受精卵在体外条件下继续培养到囊胚和孵化囊胚阶段。结果表明 ,用黄牛精子受精水牛卵母细胞 (黄×水 )或用水牛精子受精黄牛卵母细胞 (水×黄 )的种间体外受精均有较高的卵裂率 (分别为 4 6.5%和 68.4 % )。但其体外囊胚发育率分别只有 3.5%和 8.7% ,显著低于种内受精组(水×水组为 1 9.9% ,黄×黄组为 2 8.0 % ,P<0 .0 5)。在受精后 2 0 h对受精卵进行固定、染色 ,发现种间受精的黄×水和水×黄组 ,分别有 36.8%和 75.0 %的受精卵形成有 1个以上原核 ,且这些受精激活卵中大部分含 2个原核以上 (分别为 80 .9%和 80 .0 % ) ,说明种间受精的精子已进入到卵母细胞内受精并形成了雄性原核。     

水牛胎儿成纤维细胞转染外源基因的初步研究

研究了水牛胎儿成纤维细胞（buffalo fetal fibroblasts,BFF）转染外源基因后的细胞生物学特性。纯化含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和新霉素抗性基因的线性化载体,用脂质体法转染体外培养3代的BFF细胞,应用抗生素G418筛选2周后挑取转基因抗性细胞集落扩大培养。结果发现：经过G418筛选后细胞增殖活力下降,胰蛋白酶消化法共分离获得162个转基因水牛阳性细胞集落,转移到24孔板扩大培养后,132个（85．2％）细胞集落可以存活,转移到4孔板中后仅有52个（32．1％）细胞集落能继续生长,最终能在35mm培养皿中大量培养的只有15个（〈9．3％）。抗性细胞由梭形、成簇生长变为多角形、不规则形弥漫生长,立体感减弱,细胞生长速度减慢,活力下降。染色体核型异常率增加,10个抗性细胞集落核型正常率平均为61％,显著低于对照组86．7％（P〈0．01）。研究结果为建立和优化BFF细胞转染外源基因平台奠定了工作基础。     

Cd、Pb、Cu、Zn、As复合污染对杂交水稻苗的联合生理毒性效应及临界值

通过室内土培试验,研究了不同浓度的Cd、Pb、Cu、Zn、As等5种重金属复合污染对水稻苗的联合生理毒性效应,并对其临界值进行了探讨。结果表明:5种重金属污染对水稻苗的联合生理毒性效应随其污染浓度的增加而显著增强,剂量—效应关系明显。除处理(1)外,其余各处理对水稻苗体的诸项生长指标的抑制均达到了极显著的程度(P<0.01),且对根长的抑制明显大于苗长。随着复合重金属污染浓度的增大,水稻苗叶片中叶绿素含量急剧减少;丙二醛(MDA)含量迅速增加;POD和SOD酶活性呈先升后降的变化趋势。铅锌尾矿和矿毒水污染对水稻苗生长和各项生理生化指标的影响也均达到了极显著程度,但在二者污染下,POD和SOD酶活性均高于对照,铅锌尾矿的毒性效应大于矿毒水。以酶活性为参考指标,可以将土壤环境质量二级标准上限值设定为土壤中Cd、Pb、Cu、Zn、As等5种重金属对该水稻品种的临界毒性效应值。     

Feeding behaviour of the asiatic elephant in South-East Sri Lanka in relation to conservation

This paper reports on important behavioural aspects of the Asiatic elephant (Elephas maximus) in South-East Sri Lanka (Ceylon), in relation to recommendations for its conservation. The activity cycle of the elephant has been investigated in relation to local or short-range movements which were found to be diurnally rhythmic. The elephant was estimated to spend about 17 to 19 h/day feeding. The feeding cycle is seen to consist of three successive phases, namely (1) rapid movement and low feeding rate, (2) little movement and high feeding rate, and (3) a certain amount of movement and relaxed feeding. During a given feeding cycle an elephant consumes about 150 kg of fresh vegetation and defecates about 80 kg of it per day. The dynamics of grass feeding were worked out for a herd of elephants in the Gal Oya National Park. The outlook for the elephant population in South-East Sri Lanka has been critically analysed with reference to its mode of habitat utilisation. The main constraints introduced into its ecosystem are discussed, namely blocking of migratory routes, burning of grassland, construction of roads, grazing of domestic cattle in its home ranges, felling of trees by villagers, and an over-population of water buffalo (Bubalus bubalis). Measures for conservation are briefly dealt with.