龙眼水通道蛋白基因(DLPIP1)的克隆与表达分析

应用蛋白质组学研究低温胁迫下龙眼叶片蛋白质组变化时,发现PIP1蛋白在龙眼低温胁迫中上调表达。应用RACE技术克隆龙眼水通道蛋白基因全长cDNA,命名为DLPIP1,基因登陆号为JN572691,长度为1 132 bp,包括1个900 bp的开放阅读框,编码299个氨基酸序列,同源性分析表明,DLPIP1在21个不同植物中的一致性为90%~93%。应用生物信息学软件对DLPIP1氨基酸序列分析表明,含有7个跨膜区,有2个NPA单元,其氨基酸残基与MIP家族蛋白保守区序列完全一致。氨基酸序列比对发现,该序列与其他物种PIP质膜水通道蛋白氨基酸序列有很高的同源性。利用实时荧光定量技术对DLPIP1在低温胁迫下不同组织表达谱分析表明,DLPIP1在龙眼根、茎、叶中都有表达,在根中的表达量最高,其次是茎和叶。DLPIP1在低温胁迫时,随着低温胁迫时间的延长而发生变化。这说明DLPIP1蛋白在龙眼低温逆境过程中起作用。     

茄子SmNAC1 基因的克隆与表达分析

 以茄子幼苗为试材,利用cDNA 末端快速扩增（RACE）技术获得SmNAC1 基因全长,并利 用RT-qPCR 技术检测该基因在GA、4 ℃低温、NaCl 处理下的时空表达。结果显示：SmNAC1 全长序列 1 279 bp,开放阅读框为909 bp,编码302 个氨基酸,推测其蛋白质分子量约35.04 kD;SmNAC1 含有 NAC 家族的N 端保守域,与番茄、马铃薯同源性高达90%。SmNAC1 受GA、低温和高盐诱导,表达上 调,但在根、茎、叶中的表达量有差异,在根中表达水平整体高于茎和叶中,显示SmNAC1 在根中优势 表达,且短时间（0.5 ~ 1 h）相对表达量较高,而在茎和叶中应答相对迟缓,且叶中表达水平趋于稳定。 可见SmNAC1 可能参与了茄子对外源GA 诱导的响应及对低温、高盐胁迫的耐受调节过程。     

南瓜热激蛋白相关基因CmHSP70-5 的克隆和高温胁迫下的表达分析

基于南瓜基因组序列，采用PCR 的方法从南瓜cDNA 中克隆1 个热激蛋白相关基因，命名为CmHSP70-5，采 用生物信息学方法分析该基因编码的蛋白与其同源蛋白的系统发育关系，利用荧光定量PCR 研究南瓜幼苗在高温胁迫下 CmHSP70-5 基因的表达量。结果表明：CmHSP70-5 基因全长1 953 bp，其编码的CmHSP70-5 蛋白与拟南芥AtHSP70-5 的亲缘关系最近。未经高温处理时CmHSP70-5 基因在根中的表达量要显著高于茎和叶。在高温胁迫下，根、茎、叶中 CmHSP70-5 基因均呈现上调表达，均在处理后3 h 表达量达到最大，说明CmHSP70-5 基因的表达与南瓜高温胁迫有关。     

香蕉海藻糖-6-磷酸合成酶基因MaTPS2克隆及表达特性分析

在获得MaTPS2基因全长序列的基础上,采用同源序列比对、聚类分析、实时定量PCR等技术初步探讨香蕉MaTPS2基因的功能。从香蕉A基因组中获得一条3 277bp MaTPS2全长序列,包含一个完整的开放阅读框1 344bp,编码蛋白含447个氨基酸。其氨基酸理化性质分析表明,MaTPS2蛋白属于不稳定疏水性蛋白,具有一个结构域GT1-TPS。通过与已知植物的TPS氨基酸同源序列比对,同源性达77.95%。系统发育树进化关系分析表明,MaTPS2编码的氨基酸序列与银杏TPS氨基酸序列(AAX16014.1)邻近,说明二者的亲缘关系较近。器官特异性分析表明,MaTPS2在香蕉植株的根、球茎、假茎、叶、花各器官中均有表达,其中在球茎、假茎和叶中表达量较多,在果实中表达量较低。在ABA、干旱、盐害和枯萎病菌胁迫处理下,MaTPS2表达量升高,在ACC胁迫处理下,MaTPS2表达量显著下降,而低温胁迫条件下,MaTPS2表达不响应。由此推导,MaTPS2可能参与调控香蕉抗旱、抗病机制。植物生长调节剂ACC和ABA胁迫处理说明MaTPS2的表达可能受激素蛋白间接调控。     

矮牵牛B-box型锌指蛋白基因PhBBX8的克隆与表达分析

利用矮牵牛（Petunia hybrida）基因表达谱芯片筛选出应答低温胁迫的相关基因,从中发现1个B-box型锌指蛋白基因PhBBX8。通过RT-PCR克隆得到该基因的编码区序列（CDS）,为1 242 bp,预测其编码氨基酸413 aa,N端含有2个B-box盒,C端含有1个CCT结构域。系统进化树分析发现,PhBBX8与拟南芥AtBBX8等聚类为一支。利用半定量RT-PCR检测其在根、茎、叶和花中的表达特性,结果表明该基因在花中表达量较高,其次为根,而在茎和叶中表达较弱;利用实时定量PCR检测了在低温、干旱、ABA、MeJA、高盐和高渗胁迫处理下矮牵牛叶片中PhBBX8的诱导表达情况,结果表明,PhBBX8表现出不同程度的上调,其中除干旱胁迫外,其他胁迫下上调倍数都较高,初步推测该基因与矮牵牛应答低温等非生物逆境相关。     

菠萝锌指蛋白基因AcRCHY1的克隆与表达分析

 根据植物C3HC4型兼CHY型锌指蛋白的功能保守区设计简并引物, 通过RT2PCR结合RACE 方法从菠萝(Ananas comosus L. Merr) 幼苗中克隆获得了一个新的菠萝锌指蛋白基因cDNA全长, 将其命名为AcRCHY1。该基因cDNA全长1 261 bp, 开放阅读框ORF为918 bp, 推测其编码一个含有306个氨基酸残基的多肽。AcRCHY1蛋白具有保守的C3HC4 (RING finger) 和CHY两个锌指结构域, 与其它植物锌指蛋白的同源性高达81%～91%。半定量RT-PCR分析表明, AcRCHY1 在菠萝中呈组成性表达, 在子房、花瓣和小花中的表达量明显高于根和叶; 低温、高盐、干旱和ABA等非生物胁迫处理后, AcRCHY1在叶片中的表达明显增强。因此, AcRCHY1蛋白可能与花器官生长发育的调控有关, 而且可能作为一个转录调控因子在菠萝响应低温、高盐和渗透胁迫过程中参与了依赖ABA的信号转导途径。     

菠萝锌指蛋白基因AcRCHYI的克隆与表达分析

根据植物C3HCA型兼CHY型锌指蛋白的功能保守区设计简并引物,通过RT-PCR结合RACE方法从菠萝(Ananas comosus L.Merr)幼苗中克隆获得了一个新的菠萝锌指蛋白基因cDNA全长,将其命名为AcRCHY1.该基因cDNA全长1 261 bp,开放阅读框ORF为918 bp,推测其编码一个含有306个氨基酸残基的多肽.AcRCHY1蛋白具有保守的C3HC4(RING finger)和CHY两个锌指结构域,与其它植物锌指蛋白的同源性高达81%-91%.半定量RT-PCR分析表明,AcRCHY1在菠萝中呈组成性表达,在子房、花瓣和小花中的表达量明显高于根和叶;低温、高盐、干旱和ABA等非生物胁迫处理后,AcRCHY1在叶片中的表达明显增强.因此,AcRCHY1蛋白可能与花器官生长发育的调控有关,而且可能作为一个转录调控因子在菠萝响应低温、高盐和渗透胁迫过程中参与了依赖ABA的信号转导途径.     

香蕉茉莉酸合成关键酶基因MaOPR 的克隆和表达分析

 从‘巴西’香蕉（Musa acuminata L. AAA group‘Brazilian’）根的cDNA 文库中获得了一段 12–氧–植物二烯酸还原酶OPR（12-oxo-phytodienoic acid reductase）基因的片段,RACE 扩增获得全长, 命名为MaOPR。该基因全长1 512 bp,存在一个完整的开放阅读框1 287 bp,编码429 个氨基酸。生物 信息学分析表明,该蛋白属稳定蛋白,等电点为8.11,具有一个活性位点,一个基质结合位点,一个黄素 单核苷酸结合位点。序列预测分析该蛋白亚细胞定位为细胞质,其不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。通 过和已知植物的12–氧–植物二烯酸还原酶基因相比,同源性达到66%以上。其中与苜蓿、谷子、粳稻、 紫云英的OPR 编码的氨基酸序列的同源性均为71%。器官特异性分析表明,MaOPR 在香蕉的根、茎、 叶片、花和果实中均有所表达,其中在茎和果实中表达量较高。通过对其在ABA 抑制剂、乙烯、枯萎病 胁迫下的表达结果分析显示,该基因响应以上3 种胁迫。     

龙眼亚硫酸盐氧化酶(DlSO)基因的克隆及表达分析

【目的】探讨龙眼果实亚硫酸盐氧化酶基因(DlSO)在硫残留生物降解中的作用。【方法】以龙眼总RNA为模板,采用RT-PCR结合RACE法获得龙眼亚硫酸盐氧化酶基因全长cDNA序列,命名为DlSO;运用荧光定量PCR对其表达量进行分析;使用ClontechIn-Fusion技术构建原核表达载体,使其在Rosetta(DE3)大肠杆菌中表达。【结果】DlSO序列全长1413bp,包含一个1182bp的开放阅读框,一个长37bp的5’非翻译区序列和194bp的3’非翻译区,预测编码393个氨基酸;同源性和系统进化分析结果均表明DlSO与毛果杨SO亲缘关系最近;荧光定量结果表明,在龙眼不同组织中,DlSO基因都有表达,其中在叶片中表达量最高,其次是花、幼果、根和果肉,在茎和果皮组织中DlSO基因的表达量最低;成功构建pET-32a-DlSO原核表达载体,经IPTG诱导后在Rosetta(DE3)大肠杆菌中成功表达。【结论】克隆了龙眼亚硫酸盐氧化酶基因(DlSO),并且成功构建了pET-32a-DlSO原核表达载体,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达出融合蛋白,为下一步研究龙眼亚硫酸盐氧化酶的作用奠定了基础。     

茶树CsSPMS基因全长cDNA克隆和时空表达分析

为探究精胺合成酶（spermine synthase,SPMS）与茶树（Camellia sinensis）耐寒性的关系,以茶树品种‘迎霜’为试验材料,利用简并引物PCR扩增技术结合5′/3′RACE方法,获得与低温胁迫相关的CsSPMS片段cDNA全长序列（GenBank登录号为KJ580429）。该序列全长1 374 bp,包含1 113 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码371个氨基酸,预测分子量41.28 kD;构建亚细胞定位载体pJIT166-GFP/SPMS,亚细胞定位结果显示CsSPMS定位在细胞核上。荧光定量PCR分析表明CsSPMS在根、茎、叶、芽、花和果中都有表达,在根、茎中表达量较高;低温胁迫处理下不同组织CsSPMS的表达量,在叶片中2 h达到峰值,而在根中12 h达到高峰;在低温条件下4个茶树品种的耐寒性与CsSPMS表达量密切相关。     

蝴蝶兰抗坏血酸过氧化物酶基因克隆及其表达研究

从蝴蝶兰（Phalaenopsis）中克隆获得了抗坏血酸过氧化物酶基因（APX）同源序列,命名为PhAPX（GenBank登录号为：FJ161977）。PhAPX cDNA全长为1 320 bp,完整的编码框为747 bp,编码249个氨基酸。生物信息学分析结果表明,PhAPX属于过氧化物酶家族ClassⅠ的成员,PhAPX蛋白可能是胞质型APX,与其他植物的APX相似性较高。real-time PCR分析表明PhAPX是一个广谱表达的基因,在蝴蝶兰根、茎、叶、花等各个部位都有表达。机械伤害和盐处理都可以诱导PhAPX表达上调,表明PhAPX在胁迫防御中起作用。     

洋葱成花素基因AcFT 的克隆与表达分析

 以春化后但尚未抽薹的洋葱品系‘1007’的叶片为试材,采用RT-PCR 结合RACE 的方法 克隆得到了洋葱成花素基因的cDNA 全长序列,将其命名为AcFT（GenBank 登录号为KF913629）。该基 因cDNA 全长791 bp,开放读码框为534 bp,推测其编码的蛋白由177 个氨基酸残基组成,等电点为7.89, 分子量为19.8 kD。将AcFT 与大葱、鸢尾等植物的成花素氨基酸序列进行同源性比对,结果显示洋葱与 其他植物的氨基酸序列同源性均在65%以上,其中洋葱与大葱的成花素氨基酸的同源性高达98.31%。实 时荧光定量RT-PCR 分析结果表明,洋葱AcFT 基因在抽薹前后的根、叶鞘、叶片、假茎和花序等不同部 位均有表达,尤以春化后抽薹前的叶片中表达量最高。     

龙眼TIR1和ABP1基因的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

AIM: To investigate the expression and the role of histone deacetylase 8 (HDAC8) in cardiac hypertrophy and the effects of valproic acid sodium (VPA, a histone deacetylase inhibitor) on the expression of HDAC8 and cardiac hypertrophy in two-kidney two-clip (2K2C) renovascular hypertensive rats. METHODS: Male SD rats were randomly divided into sham operation group, 2K2C group, high dose VPA (400 mg穔g^-1穌^-1) treatment group, low dose VPA (200 mg穔g^-1穌^-1) treatment group and candesartan (10 mg穔g^-1穌^-1) treatment group.Four weeks after surgery,the rats were intraperitoneally injected with VPA for 4 weeks. Sham operation and 2K2C rats were given vehicle for 4 weeks. All animals were sacrificed 8 weeks after surgery. The ratio of left ventricular weight to body weight (LVW/BW) was calculated and pathological changes of the myocardium were observed with HE staining. The mRNA expression of atrial natriuretic factor (ANF) and HDAC8 was examined by RT-PCR. The protein level of HDAC8 was also measured by Western blotting analysis. RESULTS: Compared with the control rats, the mRNA and protein expression of HDAC8 significantly increased in the myocardium in 2K2C rats while the mRNA and protein expression of HDAC8 was significantly decreased by VPA treatment in 2K2C rats. The mass index (as measured by LVW/BW) and cardiomyocyte cross areas were markedly increased and myocardial fibers were disordered in 2K2C rats, but these parameters were markedly reversed after treated with VPA for 4 weeks, indicating that VPA attenuated cardiac hypertrophy. Moreover, VPA also decreased the mRNA expression of ANF. CONCLUSION: HDAC8 may play an important role in cardiac hypertrophy in 2K2C renovascular hypertensive rats. VPA inhibits the expression of HDAC8 and prevents the development of cardiac hypertrophy.     

白姜花倍半萜合成酶基因的克隆及表达

以白姜花的叶片为材料,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,克隆到一个倍半萜合成酶基因的cDNA序列,其全长为1 932 bp,基因编码区共1 653 bp,编码551个氨基酸,命名为Hc-Sesqui。该基因编码蛋白的氨基酸序列与姜和玉米中的倍半萜合成酶有较高的同源性,并且含有DDXXD保守序列。通过Clustal.X进行序列分析,确定该基因属于植物萜类合成酶基因家族中的Tps-a亚族。Northern杂交的结果表明,该基因在茎、叶和萼片中均有表达。     

杜梨干旱胁迫相关水通道蛋白基因的筛选与克隆

以杜梨实生苗为材料,采用15%PEG 6000进行模拟干旱处理,利用qRTPCR、同源重组、亚细胞定位等方法,研究了不同水通道蛋白基因在15%PEG 6000胁迫条件下表达水平的变化趋势,筛选了响应干旱胁迫相关的水通道蛋白基因,并对其进行克隆和分析,以期为梨抗旱基因筛选提供参考依据。结果表明:AQPs在杜梨的根、茎、叶中均有表达,且随着胁迫时间的延长,大部分AQPs在根系中的表达水平呈先上升后下降的趋势,其中PIP2;2基因在胁迫处理3h后,相对表达量最高;从杜梨根系中克隆获得PbPIP2;2,该基因包含一个完整的846bp的开放阅读框,编码281个氨基酸。氨基酸序列比对分析结果表明,PbPIP2;2与其它近缘物种具有一致的保守功能域,其中与苹果MdPIP2;2、白梨PcPIP2;2相似度最高。洋葱表皮亚细胞定位发现PbPIP2;2基因定位在质膜上。     

苹果酰基辅酶A结合蛋白2 编码基因MdACBP2的克隆和表达分析

 酰基辅酶A结合蛋白（ACBP）是一个保守的蛋白家族,在酰基酯辅酶A的转运过程中发挥重要作用。在水稻和拟南芥中鉴定的ACBP除了参与长链酰基辅酶A的转运以外,还参与了植物对生物和非生物胁迫的反应。为了探讨在苹果树中是否也存在参与植物对逆境反应的ACBP,并可用于改良苹果品种,以提高抗逆能力,从苹果品种‘鸡冠’中克隆、鉴定了一个ACBP基因,命名为MdACBP2。MdACBP2包含一个378 bp的开放阅读框,编码包含125个氨基酸残基的蛋白质;推定的氨基酸序列中包含有一个ACB结构域,无信号肽序列。序列和结构特征表明该基因是ACBP家族ClassⅠ亚族的成员。利用荧光定量PCR技术检测MdACBP2的表达,发现在苹果的根、叶、花、幼果、枝皮、芽等组织中均有表达,在叶中的表达量最高,在幼果中的表达量最低,这一表达模式暗示MdACBP2可能参与多种生理途径。不同胁迫处理的时序表达分析表明,MdACBP2的表达能被轮纹病病原菌Botryosphaeria dothidea侵染和10% PEG渗透胁迫所抑制,低温胁迫则能诱导MdACBP2的表达,1 mmol·L^-1 Pb(NO₃)₂处理对MdACBP2的表达没有显著影响。推测MdACBP2可能参与了苹果对低温胁迫的防御反应。     

龙眼TPI基因的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

 采用RT-PCR结合RACE法，通过T/A克隆测序，获得龙眼胚性愈伤组织磷酸丙糖异构酶基因（TPI）两个类型的全长序列TPIⅠ（GenBank登录号：FJ595244）和TPIⅡ（GenBank登录号：GU073294），序列全长分别为1 084 bp和1 113 bp，其ORF都由765 bp核苷酸组成，编码254个氨基酸，与其它植物的TPI在核苷酸序列和推导的氨基酸序列的相似性较高。qRT-PCR结果分析表明，在龙眼体胚发生过程中，TPI在松散型胚性愈伤组织阶段的转录水平比较低，在胚性愈伤组织Ⅱ阶段转录水平急剧升高，并一直持续到胚性紧实球形结构阶段，球形胚阶段大幅下调，之后至子叶形胚阶段都维持在较低水平，初步证明TPI及其编码蛋白在龙眼启动体胚发生和早期体胚发育中行使重要的功能。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过SON-PCR结合RT-PCR技术获得了1个冷诱导转录因子CBF/DREB家族基因编码区全长cDNA序列,命名为FaCBF1,GenBank登录号为FJ767754。该基因包含1个长为636 bp的完整开放阅读框,编码211个氨基酸,预测分子量为23.4 kD,等电点为6.53。氨基酸同源性分析表明,FaCBF1与GenBank中登录的蔷薇科植物CBF/DREB具有较高的同源性。进化树分析表明,草莓FaCBF1与近缘属的月季、苹果和沙梨处于同一进化枝上,而与李属植物进化关系较远。半定量RT-PCR分析显示,FaCBF1能被低温、干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA诱导不敏感;在同一诱导时期在根中的表达量高于叶和茎中的表达量。     

草莓9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶基因FaNCED的克隆及表达分析

 采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆ABA合成途径中关键基因FaNCED,该cDNA全长2 228 bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1 827个碱基,编码609个氨基酸。序列分析表明,FaNCED编码的氨基酸序列与其他植物的NCED蛋白有很高的同源性。系统进化树分析显示,草莓NCED与同为蔷薇科的湖北海棠聚为一类,与橙、柠檬、温州蜜柚、葡萄等非跃变型果实NCED蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现,FaNCED基因在草莓根、茎、叶、花萼和果实中都有表达;在果实成熟过程中FaNCED的表达出现两次高峰,分别在大白果期和红果期,且在红果期表达量最高,并与ABA积累相吻合;FaNCED在果实采后1 d表达略有下降,之后急剧上升,ABA含量变化与FaNCED基因的表达基本一致。FaNCED可能参与调控ABA的合成并在草莓成熟中起一定作用。