荔枝ANS基因的克隆及其序列分析

以3个不同发育时期的‘糯米糍’荔枝果皮和幼嫩叶片为试材,对其ANS基因进行了克隆及分析。结果表明:花青素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)是花色素苷生化合成途径中的一个关键酶。利用同源克隆方法从荔枝果皮中克隆得到了1个ANS基因,该基因开放阅读框的长度为1 074bp,编码357个氨基酸。以基因组为模板,扩增得到了1 279bp的核苷酸序列与cDNA序列比对发现,基因组序列中还有1个内含子,位置在504～708bp之间。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与葡萄、可可豆、柑橘等聚为一类。     

欧洲山芥皂苷合成关键酶基因Bv-beta-AS 克隆及表达分析

 以能够产生抗虫皂苷的高抗小菜蛾资源G 型欧洲山芥（Barbarea vulgaris R. Br.）B44 为材料,利用RACE 技术克隆出皂苷合成关键酶beta–香树脂合成酶的基因（Barbarea vulgaris beta-amyrin synthase,Bv-beta-AS）。该基因编码区序列长为2 289 bp（GenBank 登录号JQ172795）,推导其编码762个氨基酸;在基因组水平上长度为4 107 bp （GenBank 登录号JQ172796）,含有15 个内含子。Bv-beta-AS编码的氨基酸具有beta–香树脂合成酶基因家族的保守序列,即DCTAE 序列和QW 特征序列,氨基酸多序列比对和进化树分析表明,该基因与拟南芥beta–香树脂合成酶基因的相似性最高,为74%。利用荧光定量PCR 对欧洲山芥在小菜蛾诱导下该基因的表达进行研究,结果表明,该基因受虫害诱导时上调表达,但是上升到12 h 达顶峰后随时间推移呈回归的趋势。从序列特征和表达模式上推测,Bv-beta-AS 可能是抗虫皂苷合成途径的一个关键酶的基因。     

茉莉花萜类合成酶基因JsTPS的克隆及其表达分析

以双瓣茉莉花[Jasminum sambac（L.）Ait]花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法,克隆了萜类合成酶基因（JsTPS）的全长cDNA,该cDNA全长为1 884 bp,其中ORF为1 491 bp,编码496个氨基酸的蛋白,分子量56 989.7 D,与原核表达结果一致。序列分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与油橄榄（Olea europaea）的TPS2具有75%的同源性,同属于α-Farnesene synthase分支。采用荧光定量PCR技术检测JsTPS在茉莉花开放过程中的表达量变化,结果表明,表达量在未开放时（18：00）最低,在半开放时（22：00）达到最高。     

刺五加鲨烯合酶基因2 cDNA的克隆与蛋白结构分析

采用RT-PCR和RACE法克隆了刺五加鲨烯合酶基因2(squalene synthase gene 2,SS2)cDNA的全长序列(GenBank登录号:JN714465)。该序列全长1 463bp,其中5’端非翻译区长10bp,3’端非翻译区长208bp,开放阅读框长1 245bp,编码414个氨基酸。该蛋白具有1个Trans_IPPS_HH保守区域、2个鲨烯合酶和八氢番茄红素合成酶特异性识别区域及2个跨膜区。氨基酸序列比对结果表明,该蛋白与五加科其它植物SS的一致性均大于90%,与刺五加SS1的一致性为91.79%。     

莲藕可溶性淀粉合成酶基因LrSSS的克隆与表达特性分析

以莲藕品种‘美人红’叶片为试材,利用RACE结合RT-PCR技术克隆得到全长4 080 bp的莲藕可溶性淀粉合成酶基因（LrSSS）cDNA序列（GenBank登录号：KP201636）,其中开放阅读框3 696 bp,编码1 231个氨基酸;该序列与甜瓜、葡萄SSS基因编码氨基酸序列同源性较高,分别达79%、69%。LrSSS 所编码的氨基酸序列包含3个典型的碳水化合物结合结构域（CBM_25）和1个淀粉合成酶催化域（Glyco_transf_5）。LrSSS 表达分析表明,莲藕根状茎膨大具3节段时,在终止叶叶片中的表达量最高,其次为后把叶叶片,终止叶叶柄表达量最少;在根状茎膨大至4节段时,LrSSS在第1、2节段根状茎中表达量较高,在第3、4节段根状茎中表达量较低,表明在第1、2节段根状茎形态基本建成后LrSSS在调控产物转化为淀粉过程中可能起到重要作用。     

扁桃SLF基因和S-RNase基因的克隆及表达分析

 以扁桃‘Pioneer’品种为材料, 利用RT-PCR及RACE技术, 克隆了1个新的SLF ( S LocusF-box ) 基因(PdSLF1) 和两个新的S-RNase基因( PdSm 和PdSn) 的cDNA。PdSLF1全长1 331 bp, 编码376个氨基酸; PdSm 全长826 bp, 编码228个氨基酸; PdSn基因全长878 bp, 编码227个氨基酸。与公共数据库中的序列进行相似性比较, 发现这3个基因所编码的氨基酸序列与其它蔷薇科植物相应基因的氨基酸序列均具有较高的一致性, PdSLF1为70.2% ～84.8% , S-RNase为59% ～83.9%。PdSLF1基因在花药中专一性表达, 而PdSm 和PdSn基因在雌蕊中专一性表达。     

菊花萜类物质代谢关键酶FAS基因的克隆及功能分析

以菊花模式品种(Chrysanthemum morifolium‘1581’)为材料,通过固相微萃取(SPME)结合GC-MS气相质谱联用技术分析其叶片及子房中次生代谢挥发物成分及相对含量,发现萜类代谢物在挥发物中占主要地位。基于转录组测序结果,从萜类合成酶基因FDS基因家族中克隆得到1个菊花法尼醇合成酶(Farnesol synthase,CmFAS)基因。其ORF全长1197 bp,编码氨基酸398个,5′端具有质体定位信号肽。进化树分析表明CmFAS属于菊科植物FDS家族,与除虫菊及艾蒿中的单萜合成酶CDS亲缘关系最近。多重比对及氨基酸序列分析证实,CmFAS具备该基因家族典型的类异戊二烯代谢催化活性保守结构域。基因时空表达分析显示CmFAS在菊花幼嫩组织中表达量最高,其次是子房与成熟叶片,但均低于菊花中另外2个FDS基因。通过大肠杆菌原核表达与酶学反应证实,CmFAS可以利用类异戊二烯代谢路径上游底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(IPP)以及菊基焦磷酸(CPP)分别产生法尼醇和菊基醇,同时具备了异戊烯基转移酶以及萜类合成酶的双重活性。法尼醇合成酶CmFAS是菊花中鉴定的第1个质体定位的倍半萜合成酶。     

香菇信息素受体编码基因片段的克隆

根据担子菌信息素受体编码基因中的保守区域设计简并引物,通过简并PCR法从香菇的原生质体单核体中扩增出508 bp的DNA片段.通过同源比对分析,推定该片段包含3个长度分别为56 bp,51 bp和50 bp的内含子,可以编码1段含有117个氨基酸残基的蛋白质序列.这段氨基酸序列与灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)和裂褶菌(Schizophyllum commune)两种担子菌的信息素受体中的同源片段均有65%的相同性和82%的相似性.     

炭疽菌诱导的枇杷病程相关基因EjPR1的克隆及其表达分析

以炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)处理的枇杷高抗品种‘Peluches’的叶片为材料,利用RT-PCR和RACE克隆技术,获得枇杷病程相关蛋白1基因的cDNA全长序列,命名为EjPR1。该基因全长为731 bp(GenBank登录号为MN92775),5′端非编码区79 bp,3′端非编码区91 bp。其中ORF阅读框为561 bp,编码186个氨基酸,蛋白质等电点为5.63,分子量为21485.34,其预测结果的理论值与原核表达结果一致。序列分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与其他6种蔷薇科植物PR1蛋白的氨基酸序列相似性在76.41%~94.36%之间。接种炭疽菌后时序表达分析结果表明,该基因在高抗品种‘Peluches’中受病原菌诱导后明显上调表达,在接种后96 h最高,但在高感品种‘森尾早生’中无明显变化,说明EjPR1可能参与了枇杷的抗病防御过程。     

荔枝败育胚S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长扩增和序列分析

 从荔枝‘桂味’的败育胚中提取总RNA，利用GeneRacer^TM Kit将RNA经去磷酸化反应、去mRNA的帽子结构及RNA Oligo连接，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，分别用SSH分离得到的胚败育相关差异表达s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的部分cDNA序列(599 bp)设计出3’和5’端基因特异引物，进行PCR末端扩增。荔枝败育胚的s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列全长为1515 bp，编码393个氨基酸，与其它物种的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的核苷酸序列同源性在79%~82%之间，氨基酸序列同源性在88%～91%之间。结果表明所获得的基因为与荔枝胚败育相关的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因。关键词：     

洋葱成花素基因AcFT 的克隆与表达分析

 以春化后但尚未抽薹的洋葱品系‘1007’的叶片为试材,采用RT-PCR 结合RACE 的方法 克隆得到了洋葱成花素基因的cDNA 全长序列,将其命名为AcFT（GenBank 登录号为KF913629）。该基 因cDNA 全长791 bp,开放读码框为534 bp,推测其编码的蛋白由177 个氨基酸残基组成,等电点为7.89, 分子量为19.8 kD。将AcFT 与大葱、鸢尾等植物的成花素氨基酸序列进行同源性比对,结果显示洋葱与 其他植物的氨基酸序列同源性均在65%以上,其中洋葱与大葱的成花素氨基酸的同源性高达98.31%。实 时荧光定量RT-PCR 分析结果表明,洋葱AcFT 基因在抽薹前后的根、叶鞘、叶片、假茎和花序等不同部 位均有表达,尤以春化后抽薹前的叶片中表达量最高。     

低温胁迫下龙眼碳酸酐酶基因（CA）的克隆与表达分析

 应用蛋白质组学研究低温胁迫下龙眼叶片蛋白质组变化时发现碳酸酐酶（CA）蛋白下调表达。利用RT-PCR方法克隆CA基因的全长cDNA,GenBank登录号JN033201,长度为1 119 bp,包括1个966 bp的开放阅读框,编码321 bp的氨基酸序列,同源性分析表明,12个不同植物同源性为81% ~ 88%。龙眼CA基因具有典型的CA结构域,并且非常保守。实时荧光定量分析结果表明,CA在龙眼根、茎、叶中都有表达,为组成型表达,在叶中的表达量最高,茎和根中的表达量最少。CA基因在低温胁迫下随着低温胁迫时间的延长而发生变化。将CA在大肠杆菌中表达,获得1个约40.5 kD的外源蛋白。推测CA表达与低温胁迫有关。     

大蒜MADS-box基因AsPI的克隆及表达分析

B类MADS-box基因在调控显花植物的花瓣和雄蕊发育过程中发挥关键作用。为初步了解大蒜花发育的分子机制,以‘阿城紫皮’大蒜(Allium sativum)的花蕾为试材克隆了AsPI(Gen Bank登录号为KY272748)。AsPI的cDNA长939 bp,开放阅读框为615 bp,编码204个氨基酸。推导的氨基酸序列显示,AsPI编码的蛋白质包含高度保守的MADS结构域(1~57氨基酸)和保守的K结构(76~140氨基酸),AsPI蛋白具有PI亚家族特有的序列特征:MADS区特征丝氨酸残基、K区高度保守序列KHExL以及C–末端的PI基序。序列比对、功能域分析及系统发育分析结果表明,AsPI属于单子叶植物B功能基因PI亚家族。半定量和实时RT-PCR检测AsPI在大蒜不同组织器官中的表达模式,结果表明,在花蕾中高丰度表达,在花茎中表达量中等,在根、假茎、嫩叶、保护叶等营养器官中表达量极低甚至不表达。     

白姜花胚性愈伤组织的诱导与植株再生体系的建立

将白姜花（Hedychium coronarium）未成熟花丝接种在MS + 4 mg ? L^-1 2,4-D + 4 mg ? L^-1 NAA + 1 mg ? L^-1 6-BA的培养基上,经过180 d的培养,诱导出3种愈伤组织：Ⅰ,浅黄色松散易碎;Ⅱ,白色疏松半透明水渍状;Ⅲ,黄色致密颗粒状。对愈伤组织继代培养基中的2,4-D、NAA和6-BA浓度进行优化,结果表明培养基中含有1 mg ? L^-1 2,4-D、0.25 mg ? L^-1 NAA、0.25 mg ? L^-1 6-BA时可获得胚性状态良好的愈伤组织。胚性愈伤组织在MS无机盐 + 0.25 mg ? L^-1 NAA + 0.5 mg ? L^-1 TDZ + 维生素B₅ + 100 mg ? L^-1谷氨酰胺 + 230 mg ? L^-1脯氨酸 + 100 mg ? L^-1麦芽提取物 + 45 g ? L^-1蔗糖的体胚诱导培养基中培养20 d后,转移到MS基本培养基上培养30 d,1 g胚性愈伤组织可获得50 ~ 60个体胚。成熟体胚在MS + 0.2 mg ? L^-1 IAA + 0. 5 mg ? L^-1 6-BA的萌发培养基上培养20 d时,体胚萌发率为85%。萌发的体胚转移到1/2 MS + 1 g ? L^-1活性炭的成苗培养基中可发育成正常植株,植株室外栽培成活率达90%。对100株再生植株的染色体数进行分析,发现3株三倍体（2n = 3x = 51）、6株四倍体（2n = 4x = 68）和2株六倍体（2n = 6x = 102）。     

银杏类黄酮糖基转移酶基因全长序列克隆及表达分析

 以银杏（Ginkgo biloba L.）雄株叶片为试材,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法,克隆到了类黄酮糖基转移酶（UDP-glycose：flavonoid glycosyltransferase,UFGT）基因GbUFGT的全长cDNA序列,其在GenBank中的注册号为JN640564.2。该基因编码区长1 491 bp,编码496个氨基酸。GbUFGT蛋白具有保守的PSPG基序、UDP–葡萄糖基转移酶和UDP–葡萄糖醛酸基转移酶结构域,与其他植物中的UFGT蛋白同源性较高。GbUFGT基因组序列与其cDNA序列相同,无内含子。半定量RT-PCR结果表明,GbUFGT在整个银杏叶片发育期均可较高水平的表达,且不同发育期表达水平无明显变化,属非发育时期特异性基因。     

薄壳山核桃MADS-box基因CiMADS9的克隆与功能分析

以薄壳山核桃（Carya illinoinensis）‘马罕’雄花为材料,利用获得的MADS-box基因保守片段设计特异引物,通过RACE技术克隆MADS-box家族基因的cDNA序列,命名为CiMADS9。该基因长为1 077 bp,开放阅读框（ORF）768 bp,编码255个氨基酸残基。生物信息学分析表明该基因具有典型的MADS-box结构域和半保守的K区,是MIKC型MADS-box基因。聚类分析分析表明该基因属于AGL15亚家族。实时荧光定量PCR结果表明,CiMADS9在生殖器官（雄花、雌花、幼果）中的表达量高于营养器官（叶、枝条）中的,并且在雄花中的表达量最大。将目的基因通过农杆菌介导法转化拟南芥,获得了转基因植株。与对照相比,转基因拟南芥中过量表达该基因使植株开花延期,基生叶增加。     

蝴蝶兰抗坏血酸过氧化物酶基因克隆及其表达研究

从蝴蝶兰（Phalaenopsis）中克隆获得了抗坏血酸过氧化物酶基因（APX）同源序列,命名为PhAPX（GenBank登录号为：FJ161977）。PhAPX cDNA全长为1 320 bp,完整的编码框为747 bp,编码249个氨基酸。生物信息学分析结果表明,PhAPX属于过氧化物酶家族ClassⅠ的成员,PhAPX蛋白可能是胞质型APX,与其他植物的APX相似性较高。real-time PCR分析表明PhAPX是一个广谱表达的基因,在蝴蝶兰根、茎、叶、花等各个部位都有表达。机械伤害和盐处理都可以诱导PhAPX表达上调,表明PhAPX在胁迫防御中起作用。     

苹果酰基辅酶A结合蛋白2 编码基因MdACBP2的克隆和表达分析

 酰基辅酶A结合蛋白（ACBP）是一个保守的蛋白家族,在酰基酯辅酶A的转运过程中发挥重要作用。在水稻和拟南芥中鉴定的ACBP除了参与长链酰基辅酶A的转运以外,还参与了植物对生物和非生物胁迫的反应。为了探讨在苹果树中是否也存在参与植物对逆境反应的ACBP,并可用于改良苹果品种,以提高抗逆能力,从苹果品种‘鸡冠’中克隆、鉴定了一个ACBP基因,命名为MdACBP2。MdACBP2包含一个378 bp的开放阅读框,编码包含125个氨基酸残基的蛋白质;推定的氨基酸序列中包含有一个ACB结构域,无信号肽序列。序列和结构特征表明该基因是ACBP家族ClassⅠ亚族的成员。利用荧光定量PCR技术检测MdACBP2的表达,发现在苹果的根、叶、花、幼果、枝皮、芽等组织中均有表达,在叶中的表达量最高,在幼果中的表达量最低,这一表达模式暗示MdACBP2可能参与多种生理途径。不同胁迫处理的时序表达分析表明,MdACBP2的表达能被轮纹病病原菌Botryosphaeria dothidea侵染和10% PEG渗透胁迫所抑制,低温胁迫则能诱导MdACBP2的表达,1 mmol·L^-1 Pb(NO₃)₂处理对MdACBP2的表达没有显著影响。推测MdACBP2可能参与了苹果对低温胁迫的防御反应。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过SON-PCR结合RT-PCR技术获得了1个冷诱导转录因子CBF/DREB家族基因编码区全长cDNA序列,命名为FaCBF1,GenBank登录号为FJ767754。该基因包含1个长为636 bp的完整开放阅读框,编码211个氨基酸,预测分子量为23.4 kD,等电点为6.53。氨基酸同源性分析表明,FaCBF1与GenBank中登录的蔷薇科植物CBF/DREB具有较高的同源性。进化树分析表明,草莓FaCBF1与近缘属的月季、苹果和沙梨处于同一进化枝上,而与李属植物进化关系较远。半定量RT-PCR分析显示,FaCBF1能被低温、干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA诱导不敏感;在同一诱导时期在根中的表达量高于叶和茎中的表达量。     

甘蓝自交不亲和相关转录因子BosiPA1 蛋白基因的克隆与表达分析

 通过自交不亲和甘蓝‘A1’自花授粉1 h 和未授粉柱头蛋白质表达谱的对比,鉴定出1 个受 自花授粉诱导上调表达的蛋白,通过PCR 技术获取了其编码序列,命名为BosiPA1 蛋白,其基因全长为 3 730 bp,具有1 个1 092 bp 的完整编码框（KF314579）。BosiPA1 由6 个外显子、5 个内含子组成,编码 363 个氨基酸。序列分析表明BosiPA1 蛋白具有典型的basic helix-loop-helix（bHLH）功能域,在SCR、SRK、 Exo70A1 基因的ATG 上游启动子序列中存在可以被bHLH 功能区识别并结合的E-box（CANNTG）序列。 在分子进化上甘蓝BosiPA1与AtbHLH128 距离最近,与AtHEC1/2/3 和TgGBOF-1 处在同一个分支。RT-PCR 检测表明甘蓝BosiPA1 基因在花瓣、萼片、花粉、柱头和叶片中均有表达;荧光定量PCR 分析表明BosiPA1 基因在自花授粉10 min、30 min、1 h 的柱头中呈逐渐上升趋势。上述结果说明BosiPA1 与bHLH 的进化 分支较早,可能是一个参与甘蓝多器官发育的自交不亲和相关的转录因子。