猪圆环病毒的分子生物学检测

根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV-2)基因组序列,利用Primier5设计了一对特异性引物,分别采用CTAB法和DNA试剂盒提取猪脾脏总DNA,用PCR方法扩增猪PCV-2基因保守区序列,并对PCR扩增程序进行优化,对PCR检测方法的敏感性、重复性做了研究。结果显示扩增的目的片段约为573 bp,94°C 30 sec,60°C 30 sec,72°C 30 sec,30个循环扩增效果最好;模板DNA最低稀释倍数为100倍,即能检测到最低模板DNA的质量为25.8 ng;同一组织不同部位PCR检测的重复性较好;该检测方法为PCV-2的快速检测提供了方法和依据。     

三种不同核酸分析系统的效率比较分析

以4种转基因玉米基因组DNA为研究对象,使用转基因事件特异性引物进行普通PCR及多重PCR扩增,并分别应用普通琼脂糖电泳以及ABI 3730XL、岛津MultiNA、QIAGEN QIAxcel这3种核酸分析仪进行分析,比较了各种检测方法的优缺点。研究结果对不同检测需求的核酸片段大小分析方法提供了重要参考。     

一种适于PCR检测病毒诱导基因沉默番茄植株的微量DNA提取方法

【研究目的】为了寻找一种适用于病毒诱导的基因沉默番茄叶片PCR检测的快速、简单、成本低的DNA提取方法。【方法】笔者根据PCR反应的要求,用改良的CTAB法,实现了微量番茄叶片基因组DNA的快速提取。【结果】提取基因组DNA所用的组织量虽少,所得的DNA经过电泳检测虽有降解,但足以用于PCR检测,以其作模板扩增中国番茄黄化曲叶病毒诱导的硫黄素酶(Su)基因沉默植株中病毒组分中的DNAmβ和1.7A,片段大小分别为500bp、1300bp。测序结果证明是相应基因的部分片段。【结论】该方法的材料不需要使用液氮,可以单人大批量提取,并在基因沉默的番茄植株中能稳定而准确的规模化PCR检测。     

鸡传染性贫血病毒、网状内皮增生症病毒与禽白血病病毒基因芯片检测方法的建立

基于多重PCR技术,建立鸡传染性贫血病病毒(CAV)、禽网状内皮增生症病毒(REV)、禽白血病病毒禽(ALV)A、C、D亚群的基因芯检测方法。根据NCBI收录的鸡传染性贫血病毒(CIAV)、禽网状内皮增生症病毒(REV)与禽白血病病毒(ALV)A、C、D亚群参考毒株的序列,设计合成特异性扩增引物及探针,将下游引物进行Cy3荧光标记,制备基因芯片;分别提取几种病毒的基因组DNA,进行PCR扩增后与探针进行杂交,荧光检测仪扫描并分析结果。结果表明:制备的芯片能够同时检测CIAV、REV与ALV A、C、D亚群,该方法对病毒的最低检测限为106copies/m L,特异性试验结果表明,该方法与NDV、MDV和IBDV均无交叉反应,可快速鉴别ALV、REV、CIAV。为今后在临床应用中快速鉴别诊断CIAV、REV与ALV A、C、D亚群提供了可行性。     

用改进的SSAP方法克隆抗甘薯茎线虫病相关的RGA

甘薯新品系农大603是从感茎线虫病品种徐薯18的辐照后代中获得的一个抗茎线虫病的突变体。根据已报道的植物线虫抗性基因的核苷酸结合位点(NBS)保守氨基酸序列设计兼并引物，用自行改进的SSAP(modified sequence-specific amplification polymorphisms)方法，对农大603和徐薯18的基因组进行PCR扩增，从农大603中扩增出含有抗性基因NBS保守序列的差异片段2个(片段54和片段72)。在GenBank上序列搜索和比对发现，克隆序列与已报道的植物抗病基因之间同源性较低。根据克隆片段的DNA序列设计引物，以抗、感茎线虫病的甘薯品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果显示由片段72设计的引物在抗、感品种上没有扩增出多态性带；由片段54设计的引物在抗病品种和感病品种之间扩增出多态性带，推测片段54是与甘薯抗茎线虫病有关的RGA。     

科技前沿

美国研究人员最近开发出一种核酸（DNA和RNA）快速扩增技术，使聚合酶链式反应（PCR）的速度大大加快，可在3min内将基因组片段扩增10亿倍。迅速识别出病原茵。疾病快速诊断有望很快成为现实。市场对这种设备的需求将是巨大的，除传统的公共卫生和医疗研究领域，一台简单实用的实时PCR设备在养殖、农业以及食品加工行业都非常有用，可用来保障食品安全。     

SPF鸡胚St3galⅠ基因的克隆及其在MDCK细胞中的表达

为了提高MDCK细胞表面禽流感病毒(AIV)受体的水平,以12日龄的SPF鸡胚为试材,通过反转录PCR扩增唾液酸转移酶Ⅰ基因(St3galⅠ),并将回收的片段插入到pMD18-T载体中。酶切pMD18-T-St3galⅠ和pCI-neo质粒,将目的片段进行连接,构建含有St3galⅠ基因的真核表达载体。利用脂质体介导法转染MDCK细胞,在G418的筛选下,获得具有抗性的转基因细胞系。通过细胞克隆化培养和PCR检测,筛选可稳定表达St3galⅠ基因的细胞株。结果表明,从鸡胚中克隆的St3galⅠ基因成功的插入到pCI-neo质粒,从而实现真核表达载体pCI-neo-St3galⅠ的构建。在G418选择压力下,初步获得了稳转目的基因的MDCK细胞系。将抗性细胞混合克隆进行稀释,经选择后挑选出30个单克隆抗性细胞株。分别以转染细胞基因组DNA和总RNA为模板,经PCR检测显示,目的基因已整合入MDCK细胞的基因组中并可稳定的进行表达。     

道地中药材川贝母特异性PCR鉴别方法研究

为建立快速检测中药材川贝母成分的特异性PCR法,从NCBI数据库下载植物HMGR基因序列,根据同源性区域设计兼并引物,对川贝母及其易混品鳞茎基因组进行扩增。通过比对川贝母特异性DNA片段区域,设计引物扩增获得川贝母基原物种特异核酸片段。从川贝母基原鳞茎中提取DNA,设计特异引物对BMH-TF/BMH-TR,优化PCR扩增条件,通过特异性、灵敏度实验验证,建立特异性PCR检测体系。采用该方法从川贝母基原中扩增出一条120 bp左右条带,而非川贝母样品、空白对照在相同条件下无扩增条带,检测灵敏度为2 ng/μL,检测下限为4 ng。对10个市售药材的检测结果证明,该方法简便可行、重现性好。该PCR法可快速、准确鉴别川贝母基原,具有操作简便、快速、特异性高的优点。     

鸡、 猪大肠杆菌ESBLs基因型检测及耐药性分析

为检测不同动物源大肠杆菌中超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因型,探究ESBLs对大肠杆菌耐药性的影响,指导兽医临床有效防治大肠杆菌病.采用NCCLS标准方法和双纸片协同法,对102株大肠杆菌菌株进行抗菌药物敏感性测定和和ESBLs检测,设计合成4对引物,用PCR方法进行了ESBLs耐药质粒的DNA扩增和基因型分析.结果表明:以产ESBLs细菌的耐药质粒为模板扩增出了与预期片段大小相符的TEM、CTX-M型ESBLs产物,但均未扩增出SHV、OVA型ESBLs产物.鸡源、猪源产ESBLs菌株检出率分别为81％、6％.CTX-M、TEM型为山东莱西地区动物源产ESBLs大肠杆菌菌株的流行基因型,且鸡源产ESBLs大肠杆菌菌株分布广泛,应加强当地产酶耐药菌的监测和研究,以有效防治此类细菌引发的疾病.     

羊环形泰勒虫单管套式PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立羊环形泰勒虫单管套式PCR检测方法并初步应用于临床检测。根据GenBank上发表的环形泰勒虫Tams1基因序列,设计内、外2对特异性引物,进行单管套式PCR检测方法研究,并进行了特异性、敏感性试验及临床应用试验。结果表明：该检测方法能够扩增的基因片段大小为476 bp,与GenBank收录的相关序列同源性高达93%~98%,而与附红细胞体、新孢子虫、艾美耳球、弓形虫RH株相关病原基因组均无交叉反应,能够检测出DNA的最小量为12 fg。并对57份临床样品进行了检测,检测阳性率为40.4%,高于常规PCR和血涂片镜检测,表明该检测方法具有较高的敏感性,可用于羊环形泰勒虫感染的早期诊断,有较好的临床应用价值。     

鸡贫血病毒VP1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据鸡贫血病毒Cux_1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因。将扩增出的片段克隆到pGM_T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux_1株的VP1基因序列一致。然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET_32a( )载体上并进行原核表达。SDS_PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应。     

逆转录病毒法制备转基因鸡的方法分析

随着生物制药业的迅速发展,转基因鸡已逐渐成为生物领域研究的热点之一。为建立和优化逆转录病毒法制备转基因鸡技术平台,以pHIT-Myc3为载体,以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为标记基因,采用共转染法包装泛嗜性VSV-G假逆转录病毒,浓缩后分别体外侵染鸡胚胎成肌细胞和体内胚盘下腔接种新生种蛋并孵化出雏。分别抽提成肌细胞、孵化5d的全胚和新生雏鸡不同脏器的基因组DNA进行PCR鉴定分析,结果分别在细胞和5d全胚胎及新生雏鸡的胸腺和皮肤中检测到了标记基因EGFP的存在,表明逆转录病毒法成功制备出转基因鸡,同时转基因鸡技术平台中的方法技术条件也得到了有效优化,为转基因鸡的进一步研究提供参考     

拯救鸡传染性贫血突变株对宿主细胞生长周期及凋亡的影响

目的：通过流式细胞术观察拯救CIAV M突变株对宿主细胞MSB1的生长周期及凋亡的影响。方法：拯救CIAV M突变株接于MDCC-MSB1细胞系（试验组）,并相应设立阴性组（正常SPF鸡肝脏细胞液）,阳性组（CUX-1标准毒株）,进行培养24hr-48hr。用PI及FITC Annexin V染色方法,用流式细胞仪测定宿主细胞生长周期及凋亡,并用SPSS13.0进行结果统计学分析。结果：接种拯救CIAV M突变株的宿主细胞G0/G1期的累积细胞百分率为59.33%±4.04%,S期为32.92%±3.65%,G2/M期为7.75%±3.11%,与阴性组相比,G0/G1期细胞累积百分率有所上升;与CUX组相比,G0/G1期有所下降,但结果经统计学分析,差异均不显著（P>0.05）。试验组宿主细胞凋亡率为37.00%±4.65%,与阴性组相比,凋亡率上升,统计学差异显著（P<0.05）;与阳性组相比,凋亡率下降,统计学差异显著（P<0.05）。结论：本次试验结果显示,经过VP3基因突变的CIAV M突变株,经过病毒拯救并回归本动物后,对宿主细胞MSB1的生长周期没有显著的抑制,但能引起宿主细胞的显著性凋亡,且凋亡程度与CUX-1引起的宿主细胞凋亡率相比有所降低。可以表明,通过VP3密码子移位的基因突变,能够将CIAV的致凋亡作用降低,从而相应降低病毒的致病性,为以后构建CIAV减毒疫苗株奠定理论基础。     

林甸鸡和大骨鸡微卫星DNA标记遗传多样性的比较研究

为了从分子水平上揭示林甸鸡和大骨鸡的群体遗传结构,利用鸡基因组中5个微卫星标记,检测了林甸鸡和大骨鸡群体的遗传多样性。同时探讨了林甸鸡和大骨鸡在国内几个地方鸡种中的系统地位。结果表明,5个微卫星位点共检测到38个等位基因,其中ADL0146位点的等位基因数5个,为最少,而ADL0136和ADL0185两个位点的等位基因数9个,为最多;5个微卫星位点的平均等位基因数为7．6个。林甸鸡群体内比大骨鸡群体有更丰富的遗传多样性。聚类分析结果显示,林甸鸡和大骨鸡与边鸡、日照麻鸡及寿光鸡之间有比较密切的亲缘关系;而林甸鸡和大骨鸡与鲁西斗鸡的亲缘关系均较远。总体而言,该系统聚类结果与7个鸡种的分化与选育历史是一致的。     

Methods for detecting the cassava bacterial blight pathogen: A practical approach for managing the disease

Cassava bacterial blight (CBB), caused by Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam), is a particularly destructive disease in South America and Africa. The movement of infected asymptomatic stems is a major means of pathogen dispersal as well as infected seeds. The success of a cassava-seed certification program depends on the availability of reliable tests to detect the pathogen in vegetative planting materials and true seeds. We report here the different methods that permitted to detect the pathogen in cassava tissues. A polymerase chain reaction (PCR) test was developed for this pathogen. The PCR assay worked well for pathogen detection in extracts from leaf and stem lesions and the minimum number of cells that could be detected ranged from 3 × 10² to 10⁴ CFU per ml. Nested-PCR worked well for Xam detection from naturally infected seeds. This technique was specific, sensitive, and rapid for detecting Xam in cassava true seeds. The highest detection level found was 1–2 viable cells per reaction. A dot-blot assay was developed by evaluating a 898 bp DNA fragment unique to Xam strains as a diagnostic DNA probe. The probe detected Xam strains in crude extracts of leaf and stem lesions, cassava fruits and sexual seeds that were naturally infected. Overall sensitivity of the dot-blot method was about10³CFU per reaction. The dot-blot hybridization technique can be easily used for culture indexing. A monoclonal antibody (MAb) was also used for an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and tested with various infected tissues. Overall sensitivity of the method was about10³CFU per reaction. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

基于网络的鸡病防治与诊断专家系统的设计

目前中国鸡病防治中存在一些暂时无法解决的难题,如基层中鸡病诊断专家缺乏、鸡病防控不及时等。基于现状,利用计算机网络技术和人工智能技术,将SQL数据库和ASP.NET技术相结合,设计并开发了基于网络的鸡病防治与诊断专家系统。该系统将鸡病诊断和鸡病防治知识进行集成,采用基于规则的模糊化的混合推理策略,实现了鸡病诊断和防治的数字化和智能化,用户可通过网络实现鸡病诊断、鸡病防治、鸡群管理、知识查询和统计分析等功能。经验证性试验和专家评测,该系统结构合理,功能完善,可以满足广大基层用户的需求,具有一定的推广应用前景。     

Study on Genetic Polymorphism of Two Chicken Populations in Guyuan District Using Microsatellite

利用微卫星标记对中国宁夏固原地区地方品种鸡固原鸡和培育品种鸡固原红鸡两个群体DNA水平上的遗传多态性进行了研究,探讨群体内的遗传多态性,为种质资源的保护、开发、利用等提供理论依据。结果表明,利用微卫星标记分析6个位点,共检测到38个等位基因,固原鸡和固原红鸡分别发现29个和20个等位基因;平均有效等位基因数分别为4.6983和3.9385个;群体内平均杂合度分别为0.7198和0.6944。固原鸡和固原红鸡平均多态信含量分别为0.6456和0.5584,表明两个鸡群均为高度多态,均具有较为丰富的遗传多态性。     

日照琅琊鸡催乳素基因的遗传变异与就巢性的相关性研究

【研究目的】采用候选基因法研究催乳素基因的遗传变异对家禽就巢性的影响,可为控制家禽就巢性奠定理论基础。【方法】设计引物特异性扩增PRL的5’调控区序列,对PCR产物进行基因分型,统计分析不同基因型与就巢性的相关性。【结果】在所检测的琅琊鸡鸡群中发现PRL的5’调控区存在遗传变异;发现了PRL的三种基因型;统计分析结果表明,三种基因型与鸡的就巢性的遗传效应差异显著（P<0.05）,其中AA型鸡的就巢性最低,与AB和BB型鸡的就巢性存在着显著差异（P<0.05）;AB和BB型鸡的就巢性均较高,后两者差异不显著（P>0.05）。【结论】提高A等位基因的频率将有利于降低鸡的就巢性,据此可以在育种选择中实现早期基因型选种,研究结果有助于科学地保护和利用我国优良地方家禽品种资源。     

Development and application of a new codominant PCR marker for detecting 1BL·1RS wheat–rye chromosome translocations

The 1BL·1RS translocation has been widely used in wheat breeding programmes throughout the world. Unfortunately, this translocation has frequently resulted in unsatisfactory grain processing quality. Two primer combinations derived from the published sequence of a ω‐secalin gene on 1RS gave polymerase chain reaction (PCR) fragments 0.4 and 1.1 kb in size. Both fragments can be used to quickly detect 1BL·1RS translocations. By combining the PCR assay resulting in the 1.1‐kb fragment from 1RS and a PCR assay resulting in a 0.6‐kb fragment from the Glu‐B3 gene on 1BS, plants homozygous for the 1BL 1RS could clearly be distinguished from the heterozygous ones. This codominant marker was successfully applied to genotype a segregating F₂ population and a local cultivar collection.     

鸡粪堆腐过程中有机态氮形态的动态变化

鸡粪堆腐过程中有机氮形态的变化及含量关系到堆肥的农业价值,研究其变化规律,是为生产高质量的有机肥提供理论依据。利用鸡粪和玉米秸秆为原料进行了堆腐试验,研究在堆腐过程中不同形态有机氮组分的变化规律。结果表明,堆腐过程中全氮,鸡粪先降低后增加,至堆腐结束下降了30.4%,玉米秸秆和玉米秸秆+鸡粪呈现增加的趋势,分别增加了4和2.4倍;THN/TN鸡粪先降低后增加,上升了7.9%,玉米秸秆和玉米秸秆+鸡粪呈下降的趋势,分别下降了40.56%和23.15%;AN/THN,鸡粪先增加后降低,下降了13.49%,玉米秸秆和玉米秸秆+鸡粪呈现缓慢上升,比开始增加了9.7和2.1倍;AAN/THN三处理在21d均达最低值,分别增加了1.5、5.1和4倍;ASN/THN,鸡粪下降了32.5%,玉米秸秆和玉米秸秆+鸡粪分别上升了5.4%和2.9%;HUN/THN,三处理均在21d达最高值,鸡粪上升了30.9%,玉米秸秆和玉米秸秆+鸡粪分别下降了46.2%和239%。由此得出鸡粪堆腐中添加秸秆能够提高全氮的含量减少氮的损失,增加AN/THN、AAN/THN、ASN/THN的值,降低HUN/THN的值,有机态氮的有效性增加。