以金磁微球为载体的H5N1 AIV免疫PCR检测方法的建立

【目的】将高特异性的抗原-抗体反应与高灵敏性的PCR扩增技术相结合,建立快速检测低浓度H5N1禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)的免疫PCR方法。【方法】以pUC19为模板,采用5′端标记有生物素的引物进行PCR扩增,制备含有生物素的报告DNA分子。以金磁微球为固相吸附载体,通过亲和素-生物素的桥联作用,将含有生物素的报告DNA分子与生物素标记的抗AIVH5N1血凝素蛋白的检测抗体分子连接,H5N1AIV与检测抗体结合后,体外扩增报告DNA,间接放大低含量病毒信号,建立可有效检测微量H5N1AIV的免疫PCR方法。对建立的免疫PCR方法的最适报告DNA浓度、最适链亲和素工作浓度、灵敏度和特异性进行确定和评价。【结果】建立的免疫PCR方法最适报告DNA质量浓度为1ng/mL,最适链亲和素工作质量浓度为20ng/mL,该方法可成功检测到10-4EID50/mL的H5N1AIV,而且特异性良好。【结论】建立的以金磁微球为吸附载体的免疫PCR是一种灵敏度高、特异性好的检测微量H5N1AIV的方法。     

用单价STV制备单分子蛋白质-DNA复合物的研究

将生物素结合位点失活的链霉亲和素(streptavidin,STV)变异体变性后的亚基与野生型STV变性后的亚基以摩尔比3∶1的比例混合,然后重折叠复性,镍柱层析分离得到只有一个有活性生物素结合位点的突变体STV,即单价STV。将单价STV与500bp一端生物素标记的双链DNA(biotin-DNA)按不同摩尔比混合孵育,探讨使用单价STV制备1STV-1DNA复合物的可行性,并筛选制备1STV-1DNA复合物的最佳混合摩尔比。结果表明,在所用的摩尔比梯度中,单价STV与biotin-DNA混合的最佳摩尔比为1∶1,与使用野生型STV制备方法相比,使用单价STV更为简便、高效,为单分子DNA操纵、单分子DNA-蛋白质相互作用研究以及单分子DNA芯片的制备等提供了便捷的方法。     

H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法的建立

【目的】H9亚型禽流感是重要的人兽共患性传染病,该亚型病毒为H7N9亚型和H10N8亚型流感病毒提供了6个内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）,并且一直处于动态重组过程中。因此,建立针对H9亚型禽流感的型特异性电化学发光免疫的高通量快速检测方法,加强H9亚型流感的监测,具有重要意义。【方法】用钌联吡啶标记H9亚型AIV的单克隆抗体,用MPI-E型电致化学发光分析系统评价钌标单抗标记效率;用生物素标记H9亚型AIV的多克隆抗体,HABA法检测抗体生物素化的效率;待测抗原与钌标单抗作用1 h后,将此抗原-抗体复合物与通过生物素-链霉亲和素系统固定在磁微球表面的多克隆抗体反应,最后加入反应底物三丙胺后即可在电化学分析系统进行发光检测。优化生物素化多抗和钌标单抗最佳工作浓度,确定临界值和反应谱,对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性试验。攻毒后3 d和5 d,采集攻毒组和空白对照组鸡只的88份咽拭子和肛拭子,分别用电化学发光免疫检测方法和鸡胚病毒分离法进行检测和比较。【结果】钌标抗H9亚型AIV单克隆抗体的标记效率为每个单抗IgG分子上结合21个Ru²⁺,且间接免疫荧光方法证明其仍具有生物活性;生物素化兔抗H9N2亚型AIV多克隆抗体的标记效率为每个IgG分子上结合了6个生物素分子,且Western blotting试验证明其仍保持生物活性;该方法的检测临界值为28.3,可疑区间为23.4-33.2;阴性和阳性变异系数均小于10%;检测限为5×10⁴EID₅₀,能够特异性地检测H9亚型AIV,不与其他亚型流感病毒（H1、H3、H4、H5和H6亚型）和其他类型的禽源病毒（NDV、IBV和IBDV）反应。3 h内即可完成检测,与鸡胚病毒分离法的符合率为86.4%。【结论】所建立的H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法可以用于临床样品检测,对H9亚型禽流感的监测和防控具有重要意义。     

生物素化DNA与链霉亲和素绑定初步研究

将生物素标记的DNA与链霉亲和素(streptavidin,STV)按4∶1摩尔比连接,用原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)对混合物表征,观察到所有可能的几种DNA-STV复合物。并按照不同摩尔浓度比和孵育时间配制DNA与STV混合液,探讨了影响结合效率的因素,初步得到用生物素-链霉亲和素系统批量制备1STV-1DNA单分子复合物的最佳制备条件,为未来单分子DNA的大规模快速制备奠定了基础。     

兔出血症诊断方法的比较研究

应用血凝和血凝抑制试验、SPA协同凝集试验、生物素——亲和素免疫酶组化技术,检查5例健康对照兔和25例实验感染RHDV的不同发病阶段病兔的肝脏,联系病理组织学变化,比较上述3种方法在诊断RHD中的可靠性与灵敏度。结果表明:SPA协同凝集试验、生物素——亲和素免疫酶组化技术,同血凝与血凝抑制试验一样,是诊断RHD的特异、灵敏的可靠方法。三种方法比较以生物素——亲和素免疫酶组化法最灵敏,其次是血凝和血凝抑制试验,SPA协同凝集试验居第3位,但从定性角度而言此方法与血凝试验无差别。而且特异、简便。     

5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷标记内蒙古绒山羊皮肤组织的免疫组织化学检测（摘要）

探讨5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU）标记内蒙古绒山羊皮肤组织的可行性及免疫组织化学检测的最优条件。对试验组绒山羊颈静脉注射BrdU,活体背部皮肤采样,4％多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片,利用免疫组织化学技术检测切片中是否有阳性细胞分布：通过对BrdU不同注射剂量、生物素标记的第二抗体和链霉菌抗生物素-过氧化物酶各自稀释度、抗原修复方式及DNA变性温度对BrdU标记结果的影响,     

生物素的营养研究进展

生物素（ biotin）又名维生素 H，是动物机体内维持正常生理机能所必需的低分子有机化合物。自 Bateman（ 1916）和 Boas（ 1927）发现了生蛋清的毒性后，生物素作为一种保护因子被分离出来（ Kogl和 Tonnis， 1936）。其功能为 Gyorgy（ 1940）所揭示。 Vigneand（ 1942）报道了生物素的结构式， Harris等（ 1943）化学合成了生物素。由于生物素在饲料中广泛分布，并能为肠道细菌所合成，所以其重要性常被忽视。但随着生物素缺乏症在多种养殖动物中的出现，人们已重新开始认识到生物素的营养作用（ McDowell， 1989），并成为最受重视…     

嗜水气单胞菌细胞提取物特性的分析

对六株嗜水气单胞菌的全细胞和外膜成份在不同的培养条件下进行SDS-PAGE、免疫转印分析.在同一培养条件下6个供试菌株全细胞的蛋白质电泳图谱不同.同一菌株在五种不同的培养条件下,其蛋白质电泳图谱相似但有差异.6株菌株的细菌外膜提取物的蛋白质电泳图谱不同,同一菌株在5种不同的培养条件下,其蛋白质电泳图谱相似但有差异,但所有的图谱均具有34 kDa和30 kDa的条带.用Schiff's试剂,银染及生物素标记(BS-1,ConA,UEA-1)法测定及分析提取物中糖或碳水化合物的特征.生物素标记及经蛋白酶K处理后的所有菌株的提取物均显示不同分子量碳水化合物的条带,但具有相同分子量的条带,其中32 kDa条带被三种生物素及银染所显示,而34 kDa仅被生物素BS-1和UEA-1所识别.经Schiff's试剂染色后,仅出现少量的条带.用免疫转印法测定菌体提取物的抗原性,结果显示,提取物有多条不同的条带被两种血清所识别,且用活菌制备的血清比死菌的要强得多.所有菌株在不同培养条件下的提取物均具35 kDa条带被鱼血清所识别.所以,35 kDa条带可能是嗜水气单胞菌的共同抗原.同时,用ELISA法测定,证明鱼血清与其它菌株间有较强的交叉反应.     

生物素在马尾松种子园的应用效果研究

对马尾松种子园开展生物素施用试验,结果表明:生物素对提高种子园产量和质量有影响,体现在单株球果产量、出籽率、球果单粒重、种子园产量在不同处理间存在显著或极显著差异,且结合施用一定量的肥料上,施用的增产效果更为明显,其中以施复合肥250g/株的基础上施生物素100~200 g/株的马尾松性状指标最优。综合效应分析结果表明,生物素适宜的用量为100~200 g/株,种子产量可达19.60~22.40 g/株(平均11.2~12.8 kg/hm2),比同样施肥但不施生物素的对照提高185.7%~226.5%,是近几年常规经营的种子园平均产量的2倍以上。说明马尾松种子园施用生物素是可行的,为种子园产量和质量的提高提供了一条新的途径。     

猪生物素相对缺乏症的病因分析与预防治疗

猪的生物素相对缺乏症是现代养猪生产中常见的疾病之一,文章结合现代养猪现场中的几例病例报道,对猪的生物素需要、生物素相对缺乏症的原因、临床症状、预防和治疗进行探讨。