垂丝海棠MhMYB114-Like的克隆及其在苹果愈伤组织中的抗缺铁功能鉴定

从苹果砧木垂丝海棠(Malus halliana Koehne)中克隆得到了Mh MYB114-Like基因(序列号:LOC103405832)。该基因包含全长为602 bp的完整开放阅读框,编码200个氨基酸,蛋白质等电点为9.38。系统进化树分析表明,Mh MYB114-Like与野草莓该家族蛋白亲缘关系最近。分析Mh MYB114-Like的启动子区域发现包含干旱、光、生长素和黄化响应等顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,在缺铁胁迫下Mh MYB114-Like在垂丝海棠叶和根中表达水平显著上升,Mh MYB114-Like的表达明显受缺铁胁迫的诱导。将Mh MYB114-Like遗传转化‘王林’苹果愈伤组织,通过测定相关生理指标进行抗性分析发现,过量表达Mh MYB114-Like可明显提高转基因愈伤组织对缺铁胁迫的抗性。结果表明Mh MYB114-Like可响应缺铁胁迫,在抵抗缺铁胁迫中具有重要作用。     

过表达苹果多肽激素基因MdCEP1促进花青苷积累

以‘王林’苹果(Malus×domestica‘Orin’)愈伤组织为试材,初步探讨苹果多肽激素Md CEP1(C-TERMINALLY ENCODED PEPTIDE1)在调控花青苷合成方面的作用。分析显示Md CEP1位于苹果第15号染色体,只有1个外显子。蛋白序列比对显示不同物种中CEP结构域非常保守。启动子分析表明,Md CEP1启动子序列包含多个顺式作用元件,包括与分生组织有关的CAT-box元件、赤霉素响应元件(P-box)、光响应元件(MNF1)和与类黄酮合成相关的MYB类蛋白结合位点(MBSI)。通过农杆菌介导的遗传转化获得Md CEP1转基因苹果愈伤组织,进一步分析发现过表达Md CEP1能够明显促进愈伤组织花青苷积累,并且促进花青苷合成相关基因的表达。Md CEP1在拟南芥中异位表达,同样能够促进拟南芥中花青苷的积累,并且促进拟南芥花青苷合成相关基因的表达。研究结果表明,Md CEP1能够正调控苹果花青苷的合成。     

荔枝多酚氧化酶基因启动子克隆与功能分析

【目的】获得多酚氧化酶(PPO)基因启动子序列并初步分析其功能,为进一步研究PPO基因表达规律及应用PPO基因启动子提供基础。【方法】通过TAIL-PCR和接头PCR方法相结合获得荔枝PPO基因启动子序列并进行生物信息学分析,序列缺失结合瞬时表达法分析核心启动子调控元件。【结果】从‘妃子笑’荔枝基因组中克隆获得了1048bp的荔枝PPO基因启动子序列,含有多种顺式作用元件。不同长度的启动子序列均能驱动GUS基因在‘妃子笑’、‘无核’和‘紫娘喜’荔枝叶片和果皮中表达,但都不能驱动GUS基因在‘妃子笑’和‘紫娘喜’荔枝种子中表达。【结论】获得了荔枝PPO基因启动子序列并获得了其调控基因表达的部分规律。     

圆叶葡萄‘Noble’的芪合成酶STS启动子的功能分析

【目的】分析圆叶葡萄‘Noble’的芪合成酶(stilbene synthetase,STS)基因上游调控序列的顺式作用元件及其功能,为研究白藜芦醇在葡萄抗病机制中的作用提供理论基础。【方法】在前期通过染色体步移法分离得到圆叶葡萄‘Noble’芪合成酶Mr STS基因上游调控序列的基础上,利用Plant CARE在线启动子预测工具对其顺式作用元件进行初步预测,构建该启动子5’端侧翼序列缺失表达载体,启动报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达,并通过农杆菌介导法真空瞬时转化离体葡萄叶片,研究激素和霜霉菌诱导条件下GFP蛋白的活性差异。【结果】PlantCARE在线预测结果表明,Mr STS基因上游调控序列含有启动子的特定结构,如TATA-box、CAAT-box,另外也含有一些与逆境相关的顺式作用元件,如ABA响应元件ABRE、Me JA响应元件CGTCA-motif、赤霉素响应元件P-box、激发子响应元件Box-W1和胁迫响应元件TC-rich repeats等;不同诱导条件下,5’端侧翼序列缺失表达载体启动GFP蛋白的活性存在显著差异。【结论】Mr STS基因上游调控序列含有启动子核心区域和与逆境相关的顺式作用元件,并受ABA、Me JA和霜霉菌的诱导。     

苹果乙烯响应因子基因MdERF11对脱落酸的敏感性分析

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)为试材,克隆了乙烯响应因子基因MdERF11(序列号MDP0000756341)。测序发现,该基因包含全长为483 bp的完整开放阅读框,编码161个氨基酸。系统进化树分析表明,这一乙烯响应因子与拟南芥AtERF11蛋白同源序列相似性最高。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测,MdERF11启动子序列中含有与脱落酸(ABA)、乙烯及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdERF11在苹果的各组织中均有表达,在叶柄和果实中表达量相对较高;并且MdERF11的表达明显受到ABA的诱导。在外源ABA的处理下,MdERF11过量表达的苹果愈伤组织的生长势明显比野生型强,表明MdERF11降低了苹果愈伤组织对ABA的敏感性。     

苹果U-box型E3泛素连接酶MdPUB24的耐盐性和ABA敏感性鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆了一个E3泛素连接酶基因(序列号:MDP0000199588)。基因序列测序发现,该基因包含长为1 212 bp完整的开放阅读框,编码404个氨基酸。系统进化树分析表明,这一E3泛素连接酶与拟南芥At PUB24同源序列相似性最高,因此将其命名为MdPUB24。利用Plant Care数据库进行启动子顺式作用元件预测分析表明,MdPUB24启动子序列中含有与脱落酸、光、茉莉酸及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdPUB24在‘皇家嘎拉’苹果的不同组织中均有表达,且在叶片中最高;外源ABA、NaCl和低温胁迫处理能够抑制‘皇家嘎拉’苹果组培苗中MdPUB24的表达。MdPUB24过量表达的‘王林’苹果愈伤组织和异位表达的拟南芥幼苗在盐胁迫条件下,生长势与野生型相比明显变弱,表明MdPUB24负调控盐胁迫。相反,在外源ABA处理条件下,MdPUB24过量表达苹果愈伤和异位表达拟南芥与对照相比,生长势明显增强,表明MdPUB24对ABA不敏感。     

番茄SlIAA14基因启动子克隆及分析

为了深入研究SlIAA14基因的表达模式及其调控番茄根系发育的分子机理,利用染色体步移技术从番茄品种‘Ailsa Craig’中克隆到该基因上游2 197 bp的启动子片段。生物信息学分析表明,该启动子片段中含有多个对脱落酸、赤霉素、细胞分裂素等激素响应的顺式作用元件,以及对干旱和伤害等逆境胁迫响应的顺式作用元件。利用农杆菌介导的遗传转化方法获得SlIAA14：：GUS + YFP融合基因的转基因番茄植株,转基因植株根系YFP和GUS检测结果显示,该启动子片段在番茄根尖和侧根原基有较高的表达活性,表明SlIAA14基因可能调控番茄根系的伸长和侧根发育的起始。     

苹果乙烯响应因子基因MdERF11对脱落酸的敏感性分析

以‘嘎拉’苹果（Malus × domestica Borkh.）为试材，克隆了乙烯响应因子基因MdERF11（序列号 MDP0000756341）。测序发现，该基因包含全长为483 bp的完整开放阅读框，编码161个氨基酸。系统进化树分析表明，这一乙烯响应因子与拟南芥AtERF11蛋白同源序列相似性最高。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测，MdERF11启动子序列中含有与脱落酸（ABA）、乙烯及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明，MdERF11在苹果的各组织中均有表达，在叶柄和果实中表达量相对较高；并且MdERF11的表达明显受到ABA的诱导。在外源ABA的处理下，MdERF11过量表达的苹果愈伤组织的生长势明显比野生型强，表明MdERF11降低了苹果愈伤组织对ABA的敏感性。     

苹果和梨AFS基因启动子的克隆、序列比对及功能分析

苹果（Malus × domestica L.）和梨（Pyrus communis L.）果实在低温储存过程中虎皮病的发生与果皮中受乙烯诱导的α–法尼烯合酶基因（AFS）的表达及α–法尼烯的积累密切相关。采用TAIL-PCR技术分别从‘富士’苹果和‘丰产’梨中克隆到了约2 kb的α–法尼烯合酶基因（AFS）启动子序列,并提交至GenBank中（登录号分别为KM676083和KM676082）。序列比对发现两启动子同源性仅为48.31%,远低于其下游编码区97%的相似度。顺式作用元件在线预测分析发现二者同时存在乙烯、脱落酸、茉莉酸、水杨酸等激素响应元件,低温、厌氧、病原菌等胁迫响应元件,以及3个节律性表达元件和2个诱导子响应元件。对‘丰产’梨中AFS基因表达模式的分析也证实了部分预测的诱导因素对其表达有调控作用。将‘丰产’梨AFS基因启动子序列进行系列删除,与GUS报告基因构建融合表达载体转化烟草,利用GUS染色方法分析了不同长度启动子的转录活性差异,发现缩短至153 bp的启动子片段仍具有较强的转录活性,且长度在276 bp至573 bp的启动子片段其驱动下游基因转录的活性较其他片段更强。通过后续对各作用元件尤其是乙烯响应元件的研究将有助于进一步从分子水平认识虎皮病的发生机制。     

柑橘转录因子基因CitMYB22的分离、表达及亚细胞定位分析

以‘资阳’香橙(Citrus junos‘Ziyang’)为材料,利用RT-PCR技术,分离到1个MYB基因,CitMYB22。比对分析发现,CitMYB22含有两个内含子,开放阅读框(ORF)为696 bp,可编码231个氨基酸残基的多肽。氨基酸聚类和结构分析表明,CitMYB22属于MYB类转录因子家族中的R2R3-MYB亚家族。进化树分析表明,CitMYB22与拟南芥参与逆境响应的R2R3-MYB亚家族成员At MYB15的同源性最高。克隆CitMYB22的ATG上游2 500 bp内启动子顺式元件,预测其含有多个与植物逆境和激素应答相关的顺式作用元件,如HSE、SARE和MBS等。亚细胞定位结果显示CitMYB22蛋白定位在细胞核中。实时定量结果表明,CitMYB22在叶、花中的表达量明显高于根和幼果,且在外源脱落酸、水杨酸、甲基茉莉酸、1–氨基环丙烷基羧酸以及高盐、脱水和4℃低温等非生物逆境胁迫下,均被诱导上调表达,推测CitMYB22可能与‘资阳’香橙的抗逆性相关。     

番木瓜凝乳蛋白酶基因启动子的克隆及功能研究

 采用 PCR技术从番木瓜品种‘穗中红’克隆了木瓜凝乳蛋白酶基因的部分序列及其5'侧翼序列,构建含有两种长度启动子片段的植物表达载体,并用基因枪轰击番木瓜叶组织和农杆菌转化烟草叶盘。结果表明,克隆产物长719 bp,163 bp 3'侧翼序列与 GenBank中的番木瓜凝乳蛋白酶基因序列同源性为99%,556 bp的 5'侧翼序列有基础启动子区,转录起始位点位于ATG上游38bp的T。序列登录号为 AY803756。预测在启动子区存在 TATA-box、CAAT-box、WUN和HSE等顺式作用元件。两种启动子片段驱动的GUS基因瞬时表达和稳定表达结果表明,该启动子片段具有乳管特异表达活性。     

苹果生长素阻遏蛋白基因MdIAA26的分子克隆与功能鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果（Malus × domestica Borkh.）中克隆了一个生长素阻遏蛋白家族基因（基因序列号MDP0000164095）。测序发现,该基因包含长为978 bp完整的开放阅读框,编码325个氨基酸。系统进化树分析表明,这一生长素阻遏蛋白与拟南芥IAA26同源序列相似性最高,因此将该基因命名为MdIAA26。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测分析发现,MdIAA26启动子序列中含有与脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、水杨酸（SA）及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdIAA26在苹果的各组织中均有表达,在根和叶片中表达量相对较高;苹果组培苗中MdIAA26的表达明显受到ABA和IAA的诱导。MdIAA26过量表达的苹果愈伤组织在外源ABA处理下和MdIAA26异位表达拟南芥在外源ABA、PEG和IAA处理条件下,生长势均明显比野生型对照强,表明MdIAA26降低了对ABA和IAA的敏感性和对干旱的抗性。     

柑橘CsHB1启动子的克隆及功能分析

以‘伏令夏橙’叶片基因组DNA为模板,克隆了CsHB1启动子5′端转录起始位点上游分别为1 741 bp和1 613 bp的区域序列。序列分析表明这两个启动子区序列相似度为90.7%,存在141 bp的差异片段,该差异片段中含有2个Box4元件。通过PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测,结果表明CsHB1的不同启动子序列含有多种响应元件,如胚乳特异性元件、分生组织表达元件、光反应元件、热应激反应元件、MYB结合位点等。为进一步分析CsHB1启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体prCsHB1::GUS,并用农杆菌介导法转化拟南芥,获得prCs HB1-1::GUS拟南芥纯合材料13株和prCs HB1-2::GUS拟南芥纯合材料10株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色鉴定,结果表明两类启动子表达载体已成功转入拟南芥中并进行了表达,其表达部位主要集中于愈伤组织和花药中,而在种荚、叶片及幼苗中未检测到GUS蛋白的表达。     

梨矮化砧木‘中矮1号’生长素氢转运体基因PcAHS及其启动子的克隆与表达分析

以梨（Pyrus communis L.）紧凑型矮化砧木‘中矮1号’及其母本‘锦香’新梢韧皮部为试材,根据转录组测序结果设计特异性引物,克隆到1个长1 239 bp的基因序列。该序列在两个品种间不存在差异,均编码412个氨基酸,其氨基酸序列与苹果（np_001280772.1）、梅（xp_008242099.1）、毛果杨（xp_002306421.2）、草莓（xp_00428771.1）的生长素氢转运体基因（AHS）编码的氨基酸序列的相似性在67% ~ 99%之间,命名为PcAHS。qRT-PCR分析发现,‘中矮1号’新梢韧皮部中PcAHS的表达量均低于母本‘锦香’,推测其启动子序列存在差异。‘中矮1号’及其母本‘锦香’PcAHS 基因上游启动子长度分别为828 bp和888 bp,二者相似性89.1%。序列分析发现‘中矮1号’PcAHS基因启动子有一段58 bp（–496 bp ~–553 bp）的缺失;利用植物顺式作用元件数据库PLACE和PLANTCARE分析表明,‘中矮1号’启动子含有一个‘锦香’没有的BPBF转录因子结合元件P-box。推测‘中矮1号’PcAHS基因启动子特有的片段缺失和P-box转录因子结合元件可能是导致其表达量低并通过影响生长素的运输最终引起矮化的原因。     

苹果bZIP转录因子基因MdAREB2功能的初步研究

对‘嘎拉’苹果中的1个bZIP转录因子基因MdAREB2(序列号:MDP0000248567)进行功能初步研究。蛋白进化树分析表明,苹果MdAREB2与拟南芥AtAREB2具有很高的同源性。利用PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件的预测分析,MdAREB2启动子序列中存在脱落酸响应元件ABRE。实时定量PCR检测表明,MdAREB2明显受ABA诱导。拟南芥种子萌发阶段经过0.5和2μmol·L~(-1)ABA处理后发现突变体abi5中过量表达MdAREB2能够恢复对ABA的敏感性。拟南芥幼苗生长阶段,经过20μmol·L~(-1) ABA处理后发现,突变体abi5中过量表达MdAREB2能够部分恢复对ABA的敏感性。     

苹果MdCBL3基因的克隆与功能鉴定

从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆MdCBL3(序列号:MDP0000155124),长852 bp。系统进化树分析表明,苹果MdCBL3与白梨亲缘关系最近。利用PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件预测分析,MdCBL3启动子序列中存在干旱、低温、光、生长素、防御等响应元件。构建MdCBL3表达载体并利用农杆菌介导法侵染苹果愈伤组织和拟南芥。半定量RT-PCR证明MdCBL3在转基因愈伤组织中过量表达,在拟南芥中得到异源表达。表型分析发现,在盐胁迫中,与野生型相比,转基因愈伤组织和拟南芥成龄苗生长更好,盐胁迫的抗性更强。在拟南芥中异源表达MdCBL3,能提高拟南芥对干旱和低温的抗性。     

大蒜全基因组NCED基因鉴定与功能初探

采用生物信息学方法,从大蒜基因组中共鉴定出AsaNCED基因14个,预测其氨基酸数量为409～599个,蛋白分子量为46 421.95～67 090.27 Da,理论等电点为5.48～6.87。多数基因外显子数为1个,少数为11～12个。在启动子顺式作用元件中,光、脱落酸和茉莉酸甲酯响应元件在数量上占据优势,并广泛分布在不同的基因家族成员中;同时也存在与干旱相关的MYB结合位点、防御与胁迫响应元件、伤口响应元件和种子特异性调控元件。该基因家族成员在不同组织中具有一定的表达差异性。通过异源过表达AsaNCED4获得转基因拟南芥,其株高明显低于野生型,qRT-PCR分析发现AsaNCED4基因受盐胁迫诱导上调表达。     

苹果愈伤组织超表达MdNAC029促进花青苷积累

以‘光辉’海棠(Malus spectabilis‘Guanghui’)与‘王林’苹果(Malus×domestica‘Orin’)杂交后代中分离出来的红肉苹果果实为试验材料,克隆得到1个NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)转录因子基因,命名为MdNAC029。该基因开放阅读框(ORF)为843 bp,编码含有280个氨基酸的蛋白。保守结构域分析显示,MdNAC029蛋白在N端包含1个保守的NAC结构域。基因表达分析显示该基因在红肉苹果果实中表达量较非红肉果实高。在‘王林’苹果愈伤组织中超表达MdNAC029,其花青苷积累显著增加,表明MdNAC029在调控花青苷积累过程中发挥重要作用。对MdMYB1启动子序列进行分析,发现其序列包含1个MdNAC029转录因子的结合位点。同时,烟草瞬时表达试验显示,MdNAC029能够激活MdMYB1基因的表达。由此推测,MdNAC029可能通过直接促进MdMYB1基因的表达,正向调节花青苷的积累。     

苹果细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2的克隆及抗性鉴定

采用同源克隆和PCR技术从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2(基因序列号:MDP0000279125)。该基因含有1 542 bp的完整开放阅读框,编码513个氨基酸。利用Plant CARE数据库对MdCKX7.2启动子顺式作用元件进行预测分析,发现MdCKX7.2启动子序列中存在光、干旱、脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯等响应元件。基因表达分析发现,‘嘎拉’幼苗中MdCKX7.2的表达明显受干旱和ABA的诱导。通过农杆菌介导的遗传转化获得MdCKX7.2转基因拟南芥植株。抗性试验表明,异位表达MdCKX7.2基因明显提高了拟南芥对干旱胁迫的抗性。拟南芥种子萌发试验表明,在拟南芥中异位表达MdCKX7.2提高了植株对ABA的敏感性,种子萌发率和幼苗鲜质量明显下降,与种子萌发相关基因的表达量明显上调。以上试验结果表明,MdCKX7.2在植物非生物胁迫响应中发挥重要作用。     

中国野生葡萄芪合成酶基因STS19及其启动子的克隆与功能分析

以中国野生山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）‘通化3号’和刺葡萄（V. davidii Foex.）‘塘尾’为材料,克隆得到芪合成酶基因VaSTS19和VdSTS19。序列分析发现VaSTS19和VdSTS19的编码区均为1 179 bp,编码392个氨基酸,定位于16号染色体,二者核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.81%和98.21%。亚细胞定位结果显示VaSTS19和VdSTS19均定位于细胞膜、细胞质和细胞核。将35S强启动子连接VaSTS19和VdSTS19转入番茄能显著促进STS19的表达及番茄中白藜芦醇的合成和积累。分别从两种材料中克隆得到VaSTS19和VdSTS19的启动子。顺式作用元件分析表明,二者启动子中均包含多个胁迫应答元件、激素应答元件及光应答元件。序列分析发现二者启动子序列与欧洲葡萄VST2启动子序列同源性为60%。转基因烟草叶片中二者不同长度启动子片段对SA和MeJA诱导响应明显。结果表明STS19的表达模式和白藜芦醇的合成可能与其上游启动子类型和调控有关。