苹果乙烯响应因子MdERF1B-like的克隆与功能鉴定

以‘泰山早霞’苹果发育期中未着色和着色的果实为试材,利用q RT-PCR分析花青苷和乙烯通路相关基因的表达。分离出1个乙烯响应因子,暂命名为MdERF1B-like(MDP0000167207),其开放阅读框为690bp,编码229个氨基酸。在‘泰山早霞’苹果着色与未着色果实中,MdERF1B-like表达量变化与花青苷合成基因MdDFR、MdANS和调控基因MdMYB9的表达趋势一致。系统进化树分析表明,MdERF1B-like位于第Ⅸ组,与PyERF1B-like亲缘关系最近。在‘王林’苹果愈伤组织中过表达MdERF1B-like,其花青苷含量显著高于对照。分析MdMYB9启动子序列,其长度为746 bp,序列中含有1个ERF潜在结合元件RAA(TGTTG),酵母单杂表明MdERF1B-like与MdMYB9启动子结合。进一步通过荧光素酶报告试验验证MdERF1B-like促进MdMYB9启动子的转录活性。因此,MdERF1B-like可能通过对MdMYB9的调控来促进苹果花青苷积累。     

红肉苹果愈伤组织生长素信号相关基因MdARF3的克隆与表达分析

以红肉苹果‘紫红3号’(新疆红肉苹果与‘富士’F_1代)的红色幼嫩叶片为外植体诱导的红色愈伤组织为试材,初步探讨生长素调控苹果花青苷代谢机理。根据拟南芥AtARF3蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到一个生长素信号相关基因(MDP0000173151),暂命名为MdARF3。克隆测序发现该基因的开放阅读框长度为2 127 bp,编码708个氨基酸。进化树分析表明,MdARF3与AtARF3在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。愈伤组织在含有0.3 mg·L~(-1) NAA的MS培养基培养2 h之后其MdARF3上调表达,表达量极显著高于无NAA培养基(对照),而CHS、CHI、F3H、DFR、UFGT及LDOX等花青苷合成结构基因的表达量均极显著低于对照,并且MdARF3表达量与培养基中NAA浓度呈显著正相关(相关系数为0.98),与愈伤组织花青苷含量呈显著负相关(相关系数为–0.89),推测MdARF3对培养基中生长素快速做出反应调控花青苷合成;通过原核诱导获得了MdARF3的重组蛋白,为进一步研究MdARF3蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。     

苹果6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶Md6PGDH6基因的功能鉴定

【目的】探究苹果6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶Md6PGDH6基因的性质及其生物学功能。【方法】利用PCR技术得到MDP0000235230(Md6PGDH6)基因的全长,进行相关生物信息学分析,利用qRT-PCR技术研究其时空表达模式,利用农杆菌介导的转化方法获得Md6PGDH6转基因‘王林’愈伤组织,以及异源表达Md6PGDH6基因的拟南芥和烟草。【结果】MDP0000235230基因与拟南芥AT4G29120.1(At6PGDH6)归为一类,将MDP0000235230命名为Md6PGDH6基因。Md6PGDH6基因包含一个942 bp开放阅读框。在线网站预测发现,Md6PGDH6蛋白整体表现为亲水性。启动子分析发现,其含有分生组织、激素响应、环境因子和非生物胁迫响应顺式作用元件。Md6PGDH6基因在茎、果皮、果肉和种子中表达量较高,在根、叶和花中表达量较低。Md6PGDH6基因促进‘王林’愈伤组织、拟南芥和烟草的生长。【结论】Md6PGDH6在果肉中表达量较高,Md6PGDH6基因有助于‘王林’愈伤组织的生长。     

苹果愈伤组织超表达MdNAC029促进花青苷积累

以‘光辉’海棠(Malus spectabilis‘Guanghui’)与‘王林’苹果(Malus×domestica‘Orin’)杂交后代中分离出来的红肉苹果果实为试验材料,克隆得到1个NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)转录因子基因,命名为MdNAC029。该基因开放阅读框(ORF)为843 bp,编码含有280个氨基酸的蛋白。保守结构域分析显示,MdNAC029蛋白在N端包含1个保守的NAC结构域。基因表达分析显示该基因在红肉苹果果实中表达量较非红肉果实高。在‘王林’苹果愈伤组织中超表达MdNAC029,其花青苷积累显著增加,表明MdNAC029在调控花青苷积累过程中发挥重要作用。对MdMYB1启动子序列进行分析,发现其序列包含1个MdNAC029转录因子的结合位点。同时,烟草瞬时表达试验显示,MdNAC029能够激活MdMYB1基因的表达。由此推测,MdNAC029可能通过直接促进MdMYB1基因的表达,正向调节花青苷的积累。     

苹果MdCBL3基因的克隆与功能鉴定

从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆MdCBL3(序列号:MDP0000155124),长852 bp。系统进化树分析表明,苹果MdCBL3与白梨亲缘关系最近。利用PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件预测分析,MdCBL3启动子序列中存在干旱、低温、光、生长素、防御等响应元件。构建MdCBL3表达载体并利用农杆菌介导法侵染苹果愈伤组织和拟南芥。半定量RT-PCR证明MdCBL3在转基因愈伤组织中过量表达,在拟南芥中得到异源表达。表型分析发现,在盐胁迫中,与野生型相比,转基因愈伤组织和拟南芥成龄苗生长更好,盐胁迫的抗性更强。在拟南芥中异源表达MdCBL3,能提高拟南芥对干旱和低温的抗性。     

甜樱桃PavMYB10.1促进PavRiant表达和花青苷积累

为了解谷胱甘肽S–转移酶（GST）参与甜樱桃花青苷积累的机制,以甜樱桃‘美早’为试材,克隆1个phi类型GST基因PavRiant(XM＿021968160)。通过系统进化树分析、qRT-PCR、瞬时表达沉默、酵母单杂交、电泳迁移率试验和荧光素酶报告试验,探究PavRiant调控甜樱桃花青苷积累的作用。系统进化树分析表明,PavRiant与桃PpRiant蛋白序列相似度最高。果实发育期,PavRiant表达量与花青苷含量和花青苷调控基因PavMYB10.1表达量变化趋势一致。瞬时沉默试验证实PavRiant在甜樱桃花青苷积累调控中发挥重要作用。酵母单杂交和EMSA试验发现,PavMYB10.1结合PavRiant启动子的MRE序列。荧光素酶试验表明PavRiant启动子活性受PavMYB10.1正调控。因此,PavMYB10.1可能通过促进PavRiant的表达促进花青苷的积累。     

苹果细胞分裂素响应因子基因MdCRF4的分离与功能鉴定

以‘嘎拉’苹果(Malus × domestica‘Royal Gala’)为研究材料,利用同源克隆和PCR技术,分离了苹果细胞分裂素响应因子(cytokinin response factor)基因MdCRF4。该基因开放阅读框(ORF)为1077 bp,编码含有358个氨基酸的蛋白。保守结构域和系统进化树分析显示,MdCRF4蛋白包含一个保守的CRF结构域和一个保守的AP2/ERF结构域,与梨PbCRF4同源性最高。基因表达分析显示,该基因主要在苹果根和叶中表达并且响应细胞分裂素。EMSA试验显示MdCRF4原核表达蛋白能够绑定DRE(ACCGAC)序列。在‘王林’苹果愈伤组织中超表达MdCRF4,其花青苷积累显著增加,表明MdCRF4在调控花青苷积累中发挥重要作用。     

西洋梨PcHB12基因抑制果实花青苷的合成

为了解HD-ZipⅠ转录因子调控梨花青苷合成的机制,以西洋梨品种‘红茄梨’为试材,克隆了1个HD-ZipⅠ家族基因PcHB12(GenBank序列号XM009363028)。通过系统进化树分析、qRT-PCR、酵母单杂交、电泳迁移率变动分析(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和荧光素酶报告试验,探究PcHB12调控梨花青苷合成的作用。结果表明,PcHB12的开放阅读框为696 bp,编码231个氨基酸,预测的蛋白质分子量是26.77 kD。系统进化树分析表明,PcHB12与拟南芥AtHB12蛋白序列相似度最高。‘茄梨’中PcHB12的表达量明显高于其红色芽变品种‘红茄梨’,而花青苷含量和花青苷相关基因PcMYB10.1、PcUFGT的表达量明显低于‘红茄梨’。酵母单杂交和EMSA试验发现,PcHB12结合在PcMYB10.1启动子的MBS序列。荧光素酶试验表明PcHB12负调控PcMYB10.1启动子的转录活性。因此,PcHB12可能通过负调控PcMYB10.1的表达从而抑制梨花青苷的合成。     

苹果乙烯响应因子MdERF3促进花青苷和原花青苷积累

以'嘎拉'苹果(Malus×domestica'Royal Gala')为材料,克隆乙烯响应因子(Ethylene Response Factor 3)基因MdERF3。构建酵母载体pGBKT7-MdERF3和原核表达载体PET32a-MdERF3,酵母转化试验表明,MdERF3转录因子具有转录激活活性。电泳迁移率试验分析显示,MdERF3-HIS原核诱导蛋白能够直接结合GCC和DRE序列。构建pCAMBIA1300-MdERF3超表达载体,转化苹果愈伤组织和拟南芥植株,并瞬时转化苹果叶片,转基因材料花青苷和原花青苷积累显著高于野生型。以上结果表明MdERF3转录因子具有转录激活活性以及对GCC和DRE序列的结合能力;MdERF3在调控花青苷和原花青苷积累过程中发挥重要作用。     

苹果蔗糖转运蛋白MdSUT2调控花青苷积累的研究

从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆蔗糖转运蛋白基因MdSUT2(序列号:MDP0000277235),该基因包含1 704 bp开放阅读框,编码566个氨基酸,蛋白大小为56 kD。构建MdSUT2表达载体并利用农杆菌介导法侵染拟南芥,半定量RT-PCR证明Md SUT2在拟南芥中异源表达。构建瞬时表达载体,‘红星’苹果进行Md SUT2瞬时表达,其花青苷含量增多,而沉默该基因花青苷含量明显降低。     

苹果多肽激素及其编码基因MdCEP1调控拟南芥根系发育

植物多肽激素是一类经剪切后形成具有特殊功能的成熟的多肽。以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为研究试材,初步探讨多肽激素C-TERMINALLY ENCODED PEPTIDE1(CEP1)调控根系生长发育的机理,为苹果多肽激素的研究奠定基础。扩增获得多肽激素基因MdCEP1(MDP0000886459),其开放阅读框为366 bp,编码121个氨基酸。进化树分析表明,苹果MdCEP1与白梨的PbCEP1亲缘关系最近。表达分析显示MdCEP1在苹果根和茎中表达量最高,在叶和果实中相对较低;基因表达响应显示MdCEP1表达受到生长素的调控,低浓度生长素明显上调,而高浓度生长素显著抑制MdCEP1表达。外施人工合成小肽MdCEP1p~(Hyp)对拟南芥根系发育起到明显抑制作用,主根变短,侧根数减少。在拟南芥中异位表达MdCEP1,同样表现出主根变短,侧根数减少。qRT-PCR分析结果显示,外源MdCEP1p~(Hyp)处理和过表达MdCEP1均明显抑制了拟南芥根系生长素合成与转运相关基因的表达。研究结果表明MdCEP1在根系生长发育过程中起到了负调控作用。     

苹果MdAFS叶绿体定位表达对拟南芥萜类挥发物的影响

以‘青香蕉’苹果(Malus×domestica‘White Winter Pearmain’)α–法尼烯合酶基因(MdAFS)为目标基因,构建叶绿体定位的植物过表达载体,并通过农杆菌介导遗传转化拟南芥,获得使MdAFS在叶绿体中过表达的拟南芥转基因株系。将pBI122-rbcS1-pla-MdAFS-GFP表达载体瞬时表达本氏烟,分析表明叶绿体定位肽能成功将MdAFS蛋白定位到叶绿体中。定量测定莲座期和盛花期拟南芥光合色素,结果显示,转基因拟南芥叶绿素和类胡萝卜素含量较野生型显著增加。qRT-PCR分析萜类代谢相关基因转录表达水平表明,尤其在盛花期,过表达MdAFS能显著影响萜类代谢基因表达上调。应用静态顶空固相微萃取法收集拟南芥挥发物并结合GC–MS分析鉴定萜类挥发物成分,转基因拟南芥中萜类挥发物含量和种类明显增加。这些结果表明,过表达MdAFS能显著影响萜类代谢流的重新定向,增加萜类代谢挥发物。叶绿体是萜类代谢工程一个理想的亚细胞空间。     

红肉苹果冷信号基因MdICE1的表达及其蛋白与MdMYB的互作

根据拟南芥AtICE1蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到苹果同源蛋白序列,利用DNAMAN软件设计特异性引物并克隆苹果冷信号基因（MDP0000662999）,暂命名为MdICE1。以从新疆红肉苹果与‘富士’杂交F1代中选出的‘紫红3号’叶片诱导出的红色愈伤组织为试材克隆MdICE1,测序发现该基因的开放阅读框长度为1 626 bp,编码541个氨基酸。进化树分析表明,MdICE1与AtICE1在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。氨基酸序列比对发现,MdICE1存在bHLH基序。低温处理有利于苹果愈伤组织花青苷的累积;与培养在24 ℃下的愈伤组织相比,低温（8 ℃）诱导苹果愈伤组织冷信号基因MdICE1以及花青苷合成相关转录因子基因MdMYB10和MdbHLH3的表达。酵母双杂交试验证明MdICE1可以与MdMYB10相互作用;亚细胞定位发现MdICE1蛋白存在于细胞核内;转化大肠杆菌并诱导获得了MdICE1的重组蛋白,为进一步研究MdICE1蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。     

甘蓝Ogura 细胞质雄性不育相关基因BoMF1启动子的克隆及功能分析

 通过TAIL-PCR 染色体步移技术,从甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）基因组中克 隆到胞质雄性不育（OguCMS）相关基因BoMF1 翻译起始位点上游521 bp 的启动子序列。软件分析预测 表明,该启动子序列中存在多个顺式作用元件,包括TATA-box、CAAT-box、MYB 结合位点、植物激 素响应单元等。为了研究该启动子的表达特性,亚克隆了BoMF1 转录起始位点上游521 bp 序列,将其置 换pBI121 中的CaMV35S 启动子,驱动其下游的GUS 基因,构建植物表达载体pBI121-BoMF1P,以pBI121 空载体作为阳性对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法转入拟南芥。结果表明,甘蓝BoMF1 启动子序列 能驱动GUS 基因在拟南芥花药发育晚期的花药和花粉中特异表达,表达具有组织特异性。     

苹果L-LEC-RLK基因家族鉴定及响应病原真菌信号的表达分析

以L型类凝集素(Lectin-LegB;Pfam:PF00139)和激酶(Pkinase;Pfam:PF00069)保守域全蛋白序列为种子序列,鉴定了苹果(Malus×domestica Borkh.)L型类凝集素类受体激酶(L-LectinReceptor-like kinase,L-LEC-RLK)家族成员,并对其理化性状、进化特征、亚细胞定位、染色体位置和表达模式进行分析。通过鉴定,共获得41个成员,其氨基酸序列大小介于423～1 291 aa,分子量介于47.12～143.27 kD,等电点介于5.50～8.91,其中28个成员位于质膜。根据进化分析将拟南芥、水稻、马铃薯、杨树和苹果等5个物种的L-LEC-RLKs分为8个亚组,苹果L-LEC-RLKs分布于亚组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅷ。染色体位置分析表明苹果L-LEC-RLKs存在多个串联重复。该家族成员在不同组织中存在多样化的表达模式。27个成员在苹果接种腐烂病菌(Valsa mali,Vm)或斑点落叶病菌(Alternaria alternata apple pathotype,AAAP)后存在差异表达。其中,MD15G1226500和MD14G1055200的表达量在两种病害发生后都发生了显著的差异。以上差异基因可作为进一步开展抗病研究和功能分析的候选基因。     

超表达MdFLS2的拟南芥fls2突变体识别细菌鞭毛蛋白,提高对轮纹病菌的抗性

以红肉苹果‘紫红3号’愈伤组织为试材,克隆了细菌鞭毛蛋白受体基因MdFSL2,研究了其与拟南芥AtFLS2对细菌鞭毛蛋白敏感性差异以及对苹果轮纹病抗性的影响。进化树分析表明,MdFLS2与拟南芥AtFLS2亲缘关系较远,处于不同的进化树分支,与梨PbFLS2的亲缘关系最近。时空表达特异性研究表明,在苹果叶片中MdFLS2表达不随组织衰老而产生差异,能够被外源SA处理诱导,不受IAA、ACC处理影响;在根系中表达量最高,而在花与果实中表达量较低。在拟南芥中异源过表达MdFLS2,显著抑制植株生长,并出现叶片边缘枯死或细胞死亡的表型。在转基因拟南芥中受SA诱导的病程相关基因AtPR1、AtPR2和AtPR5,及衰老相关基因AtORE1和AtNAP的表达水平均显著高于野生型。为研究MdFLS2是否具有感知细菌鞭毛蛋白的能力,进行拟南芥根系生长抑制试验,MdFLS2超表达恢复了细菌鞭毛蛋白N端22个保守氨基酸肽段(flg22)对拟南芥fls2突变体根系生长的抑制作用,但flg22分别处理30和60 min,或20和40 min,flg22诱导的标志性基因表达水平及MAPK激酶活化水平在过表达MdFLS2的fls2突变体中显著低于同样处理的野生型。超表达MdFLS2提高了拟南芥叶片对轮纹病菌的抗性,并增强了拟南芥突变体fls2对假单胞菌DC3000的抗性。研究结果说明苹果MdFLS2是一个有功能的免疫相关基因,MdFLS2与AtFLS2在具体执行功能与作用机制上可能存在差异。     

苹果生长素阻遏蛋白基因MdIAA26的分子克隆与功能鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果（Malus × domestica Borkh.）中克隆了一个生长素阻遏蛋白家族基因（基因序列号MDP0000164095）。测序发现,该基因包含长为978 bp完整的开放阅读框,编码325个氨基酸。系统进化树分析表明,这一生长素阻遏蛋白与拟南芥IAA26同源序列相似性最高,因此将该基因命名为MdIAA26。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测分析发现,MdIAA26启动子序列中含有与脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、水杨酸（SA）及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdIAA26在苹果的各组织中均有表达,在根和叶片中表达量相对较高;苹果组培苗中MdIAA26的表达明显受到ABA和IAA的诱导。MdIAA26过量表达的苹果愈伤组织在外源ABA处理下和MdIAA26异位表达拟南芥在外源ABA、PEG和IAA处理条件下,生长势均明显比野生型对照强,表明MdIAA26降低了对ABA和IAA的敏感性和对干旱的抗性。     

苹果U-box型E3泛素连接酶MdPUB24的耐盐性和ABA敏感性鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆了一个E3泛素连接酶基因(序列号:MDP0000199588)。基因序列测序发现,该基因包含长为1 212 bp完整的开放阅读框,编码404个氨基酸。系统进化树分析表明,这一E3泛素连接酶与拟南芥At PUB24同源序列相似性最高,因此将其命名为MdPUB24。利用Plant Care数据库进行启动子顺式作用元件预测分析表明,MdPUB24启动子序列中含有与脱落酸、光、茉莉酸及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdPUB24在‘皇家嘎拉’苹果的不同组织中均有表达,且在叶片中最高;外源ABA、NaCl和低温胁迫处理能够抑制‘皇家嘎拉’苹果组培苗中MdPUB24的表达。MdPUB24过量表达的‘王林’苹果愈伤组织和异位表达的拟南芥幼苗在盐胁迫条件下,生长势与野生型相比明显变弱,表明MdPUB24负调控盐胁迫。相反,在外源ABA处理条件下,MdPUB24过量表达苹果愈伤和异位表达拟南芥与对照相比,生长势明显增强,表明MdPUB24对ABA不敏感。