线粒体DNA缺失质粒pMDD-Z的构建及鉴定

分别以pEGFP-Mito和pAN4质粒为模板,扩增出MTS-EGFP和EcoRⅠ基因片段,利用快速体外基因重组技术-重组PCR,将两者连接得到MTS-EGFP-EcoRⅠ片段,构建克隆载体pTRE2hyg-EE,经AgeⅠ和NotⅠ双酶切得到MTS-EGFP-EcoRⅠ融合基因产物,连接克隆于真核表达质粒pEGFP-Mito后获得pMDD-Z质粒。琼脂糖凝胶电泳结果显示,MTSEGFP和EcoRⅠ基因片段大小分别是831 bp和860 bp。测序结果显示,插入pTRE2hyg--EE克隆载体中的MTS-EGFPEcoRⅠ片段大小1 672 bp,且基因序列正确,没发生点突变。琼脂糖凝胶电泳结果显示,pMDD-Z质粒的双酶切产物分别为1 587 bp的插入片段和4 024 bp的载体片段。测序结果显示,pMDD-Z质粒中含1 659 bp的开放阅读框,编码553个氨基酸,从N端至C端,分别为线粒体信号导肽、绿色荧光蛋白和限制性内切酶EcoRⅠ,且未发生移码突变。     

牛FSHR基因5′端侧翼序列的分析和多态性研究

以中国西门塔尔牛基因组DNA为模板，参照绵羊的FSHR基因序列设计和合成引物、PCR扩增获得长度为931bp，包括5′端侧翼797bp和结构基因第一外显子区134bp的牛FSHR基因片段，将该片段克隆于PUC18载体中，作序列分析发现：牛的FSHR基因转录启动子的遗传结构与人和鼠的FSHR基因不同，它的基因转录启动区含有TATA盒和类CAAT盒序列。在检索出的转录调节元件、或特征性序列位点，牛与绵羊在5个序列位点有碱基变异，这可能与牛和绵羊的产仔率高低不同相关，对34头份中国西门塔尔牛的扩增产物，应用PCR－RFLP方法进行多态性分析，TaqⅠ酶切出现了多态性，酶切产物电泳呈现3种基因型，由2种等位基因构成，通过对基因频率和基因型频率在种用公牛，双胎母牛和随机牛类群中分布的比较研究结果，认为该基因与牛的繁殖性状存在连锁相关。     

牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的合成及真核表达载体的构建

根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的2条互补的寡核苷酸链,退火后在5′端和3′端分别形成含有BamH I和Xho I位点粘性末端的双链DNA。真核表达载体pcDNA3.1（+）经BamH I 和Xho I限制性内切酶双酶切处理后与合成的LfcinB基因进行连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒DNA进行测序。测序结果显示,牛乳铁蛋白肽LfcinB基因成功克隆到pcDNA3.1（+）真核表达载体中,为进一步表达和抗菌活性研究奠定物质基础。     

分子标记株鸭圆环病毒感染性核酸的构建

以临床分离的鸭圆环病毒（duck circovirus）（GenBank登录号：GU168779）阳性病料为材料,根据GenBank中所登录的鸭圆环病毒基困序列设计引物并对设计的引物5′末端进行磷酸化处理,通过引物设计替换碱基,以突变形成EcoRⅠ酶切位点。利用PCR方法扩增鸭圆环病毒的基因,经胶回收后,用T4 DNA连接酶进行环化,以获得鸭圆环病毒具有感染性的核酸。在含有分子标记的两端设计引物,进行PCR扩增,对PCR产物进行胶回收,连接T载体后测序,对胶回收产物进行EcoRⅠ酶切鉴定,均证明在第587位成功插入EcoRⅠ酶切位点。结果表明,本试验已成功构建带有分子标记的鸭圆环病毒的感染性核酸,为进一步开展该病毒的分子调控机制、致病性和开发基因工程疫苗研究奠定基础。     

山羊痘病毒疫苗株与野毒株PCR—RFLP鉴别方法的建立及应用

为了建立区分疫苗株与广西分离株的检测方法,根据GenBank上的山羊痘病毒序列设计1对引物,用来扩增山羊痘病毒P32基因,通过对国内疫苗株及6株广西分离株的P32基因进行克隆、测序比较发现,所有广西分离株核苷酸651位的碱基全部由T变为C,647位～652位核苷酸构成由TGTATA变异为TGTACA,多了1个限制性内切酶Bsp 1407Ⅰ位点,因此用特异性引物扩增出739bp的目的片段后,再用限制性内切酶BsP1407 Ⅰ进行酶切分析。疫苗株可以切成135hp和604bp3个片段,广西分离株可以切成135、226、378bp3个片段。结果表明,所建立的PCR—RFLP方法可以区分疫苗株和广西分离株。     

山羊痘病毒疫苗株与野毒株PCR-RFLP鉴别方法的建立及应用

为了建立区分疫苗株与广西分离株的检测方法,根据GenBank上的山羊痘病毒序列设计1对引物,用来扩增山羊痘病毒P32基因,通过对国内疫苗株及6株广西分离株的P32基因进行克隆、测序比较发现,所有广西分离株核苷酸651位的碱基全部由T变为C,647位~652位核苷酸构成由TGTATA变异为TGTACA,多了1个限制性内切酶Bsp1407Ⅰ位点,因此用特异性引物扩增出739 bp的目的片段后,再用限制性内切酶Bsp1407Ⅰ进行酶切分析,疫苗株可以切成135 bp和604 bp 3个片段,广西分离株可以切成135、226、378 bp 3个片段。结果表明,所建立的PCR-RFLP方法可以区分疫苗株和广西分离株。     

西门塔尔牛肌肉生成抑制素基因编码序列的克隆与序列分析

本研究根据Genbank中牛肌肉生成抑制素基因序列设计引物，在设计的引物两端分别加上限制性内切酶BarnHI和EcoRI的识别位点序列。利用RT—PCR技术从西门塔尔牛肌肉组织的总RNA中扩增出MSTN基因的CDNA序列，扩增出1125bp片段，该片段与pMD18-T载体连接，转化JM109感受态细胞，所得阳性克隆进行酶切和PCR鉴定，并进行了测序分析，得到的克隆序列与设计的序列基本一致，表明成功地克隆了西门塔尔牛的肌肉生成抑制素基因的蛋白编码序列。     

松辽黑猪与北京黑猪杂交后代MyoD1基因的SNP位点分析

为探究松辽黑猪与北京黑猪杂交后代黑猪MyoD1基因的单核苷酸多态性(SNP)位点与肉质性状的关系,试验提取松辽黑猪与北京黑猪杂交后代黑猪的背最长肌基因组DNA,应用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)方法分析MyoD1基因的SNP位点,并对产生SNP位点的不同基因型进行了序列分析和系统进化树比较。结果表明:PCR扩增获得了大小为631 bp的MyoD1基因片段,经DdeⅠ酶酶切,产生631 bp、256 bp+375 bp、631 bp+256 bp+375 bp 3种带型;对MyoD1基因的重组质粒PCR产物进行DdeⅠ酶酶切,产生631 bp、256 bp+375 bp 2种带型;松辽黑猪与北京黑猪杂交后代黑猪MyoD1基因存在3个SNP位点,分别是217 bp处存在CT突变位点,375 bp处存在GT突变位点,413 bp处存在TC突变位点,且位于375 bp处的GT SNP位点导致DdeⅠ酶酶切位点丢失;松辽黑猪与北京黑猪杂交后代黑猪MyoD1基因与GenBank中野猪(登录号为U12574.1)基因序列处于同一分支,而与其他物种的同源性较低,具有独特的物种特异性。     

RT-PCR及RFLP分析技术对鸡传染性支气管炎病毒的诊断和S1基因分型的研究

本研究使用分别扩增整个S1糖蛋白基因 (引物A)和S1糖蛋白基因N_端高变区Ⅰ (引物B)的 2对引物对 3个IBV标准株M41、Connecticut、Arkansas及 5个地方分离株 (C60 ,D41A ,D41B ,A112 1,A1171)进行RT_PCR扩增。用引物A时 ,有 5个IBV毒株扩增到目的片段 (172 0bp) ;用引物B时 ,所有 8个IBV毒株均得到与预计大小相符的目的产物 (2 2 8bp)。对 172 0bp的PCR产物用限制性内切酶HaeⅢ进行酶切 ,结果得出 3个不同的RFLP图谱 ,其中M41、Connecticut、D41B具有相同的HaeⅢ酶切图谱。Arkansas和D41A则分别具有互不相同的图谱 ;对 2 2 8bp的PCR产物进行DdeⅠ、RsaⅠ限制性内切酶消化 ,根据它们的RFLP图谱 ,8个IBV毒株可分为 5个基因型。综合 2对引物的PCR产物的RFLP分析结果 ,8个IBV毒株可分为 7个基因型 ,分型的结果与传统的血清学方法吻合。本研究建立的方法和技术具有快速、简单、特异、灵敏等优点 ,为现场流行毒株的定型(基因型 /血清型 )及其S1基因变异的跟踪研究以及更有效防制传染性支气管炎奠定了基础。     

重组猪细小病毒VP2基因的猪伪狂犬病毒rPRV-VP2株的构建及纯化

参考GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)(M38367.1)基因序列,设计1对可以扩增出约1.6kb PPV VP2基因片段的特异性引物,上、下游引物的5′端均引入BamHⅠ酶切位点,PCR扩增得到VP2目的片段后,连接到pMD18-T载体中得到重组质粒pMD-VP2。取本实验室构建的含绿色荧光蛋白标记基因的伪狂犬病毒(PRV)通用转移质粒pG和构建好的pMD-VP2质粒,用BamHⅠ对质粒pG和pMD-VP2进行酶切,然后用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理,纯化回收后将VP2基因插入pG质粒中获得重组伪狂犬病毒转移质粒pGVP2。用脂质体转染法将PRV HB-98株全基因组与质粒pGVP2共转染ST细胞,得到携带有PPV VP2外源抗原基因和绿色荧光蛋白标记基因的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2株。结合VP2基因PCR扩增和绿色荧光观察,经5轮病毒空斑纯化得到了纯化的重组病毒rPRV-VP2株。     

细菌人工染色体文库基因组DNA制备技术

试验旨在对基因组DNA的制备进行研究,为细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库的构建奠定基础。以豁眼鹅全血为试验材料,提取高质量的基因组DNA,分别采用HindⅢ、EcoRⅠ和BamHⅠ3种限制性内切酶对所提基因组DNA进行部分酶切,并利用控制酶切时间、设置不同的HindⅢ酶切浓度梯度对基因组DNA进行部分酶切。结果表明,HindⅢ为最佳限制性内切酶,并得到了最佳酶切用量(40U/μL)。该方法所制备的基因组DNA质量较好,可用于BAC文库的构建。     

鸭Ⅰ型肝炎病毒VP1基因片段的克隆与表达载体的构建

为研究鸭肝炎病毒VP1基因在大肠杆菌中的表达情况,根据鸭肝炎病毒核苷酸序列设计1对外引物和1对含有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的内引物。以内外引物进行PCR扩增,将所得PCR产物回收,以相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET-32a后构建重组表达载体,并转入宿主菌BL21和Rosseta,经酶切、PCR和测序鉴定,证明VP1基因正确插入了表达载体。用不同浓度的IPTG诱导VP1基因的表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,结果表明,VP1基因片段在大肠杆菌Rosseta和BL21中均难以表达。     

桑树叶绿体基因组DNA的提取及部分序列分析

改进Milligan法 ,提取了桑树叶绿体基因组DNA(cpDNA)。利用特异性引物 ,从cpDNA基因组扩增出tRNL tRNF基因。再用随机引物对同一种桑基因组DNA及cpDNA进行RAPD分析 ,表明提取的DNA是具有相当纯度的cpDNA。进一步用XbaⅠ和HindⅢ进行了cpDNA的酶切和克隆。通过酶切鉴定 ,已克隆到 5个片段 ,对其中 1个片段的 70 0bp序列进行了分析 ,推测克隆的片段可能为trnK基因的内含子。     

鸡IGF-Ⅰ基因单核苷酸多态性及其与屠体性状关系的研究

本研究采用PCR-RFLP技术,对438只黄羽矮小型肉鸡的胰岛素样生长因子-Ⅰ基因(IGF-Ⅰ)的5′端进行遗传多态性研究,发现该区域的PCR扩增产物经Hinf Ⅰ酶切后出现GG、GT和TT 3种基因型。经χ2检验,群体在该位点上处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。方差分析结果显示,性别对9个性状(活体重、屠体重、皮脂厚、半净膛、全净膛、胸肌重、腿肌重、腹脂重、腹脂率)有极显著影响(P<0.01),对肌间脂肪含量有显著影响(P<0.05)。家系效应在8个性状上(活体重、屠体重、半净膛、全净膛、胸肌重、腿肌重、腹脂重、腹脂率)达到极显著水平(P<0.01);而基因型效应只在腹脂率上达到显著水平(P<0.05),腹脂重没有达到显著水平(P=0.0669)。不同基因型的最小二乘均值间多重比较结果发现,TT型的腹脂重和腹脂率均显著低于GT型(P<0.05),而GG型和GT、TT型的差异不显著(P>0.05)。     

牛、羊布鲁菌多重PCR方法的建立与应用

根据布鲁菌属特异性基因BCSP31和布鲁菌种间特异性标志IS711插入序列,设计合成了3对引物,以牛种布鲁菌544A、104M和羊种布鲁菌16M基因组DNA为模板,通过优化反应条件,建立了可同时检测布鲁菌属、牛种布鲁菌和羊种布鲁菌的多重PCR方法。牛种布鲁菌可扩增出301和114 bp 2条带,羊种布鲁菌可扩增出301和253 bp 2条带,该方法对牛种布鲁菌544A和羊种布鲁菌16M混合DNA模板的最小检出量为100 pg,对大肠杆菌O157∶H7、小肠结肠炎耶尔森菌等15种参照菌的核酸扩增结果均为阴性。应用该方法对吉林省某牛场的106份粪便进行检测,虎红平板凝集试验作对照,结果PCR检测9份为阳性,且全为牛种布鲁菌阳性,对应的虎红平板凝集试验也为阳性。结果表明,建立的多重PCR方法具有良好的敏感性和特异性,为布鲁菌病的鉴别诊断提供了一种分子检测工具。     

绵羊DECR1基因exon 5部分序列多态性分

试验根据GenBank登录的牛2,4-双烯-CoA还原酶1（2,4-dienoyl-CoA reductase1,DECR1）基因序列（NP_001068891）设计引物,应用PCR技术对德国美利奴绵羊、杜泊绵羊、特克塞尔绵羊DECR1基因的exon 5部分序列进行克隆测序;利用PCR-SSCP技术检测了3个绵羊群体exon 5单链构象多态性（SNP）,所获序列与GenBank中其他物种exon 5序列进行了同源性比较,并构建了亲缘关系聚类分析图。结果表明,绵羊DECR1基因exon 5长为137 bp,3个绵羊群体中exon 5均不存在SNPs,各种动物之间DECR1基因exon 5的同源性较高,在81.02%（鸡）～97.08%（牛）之间,其中绵羊和牛同源性最高,达到97.08%;与鸡的同源性最低,为81.02%;聚类分析结果显示,绵羊首先与牛聚为一类,再分别与兔子、狗聚为一类,最后分别与人、猪聚为一类,绵羊与牛的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远,与传统分类相一致,说明DECR1基因exon 5在动物进化过程中高度保守。     

植物乳杆菌α-半乳糖苷酶基因（melA）的克隆与序列分析

试验以L.plantarum1.557的基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增α-半乳糖苷酶基因（melA）基因,PCR产物经纯化回收后克隆至pMD18-T载体中,转化E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒进行SacⅠ和Sph Ⅰ酶切及PCR扩增鉴定,并对melA基因片段进行序列测定。结果表明,测得的melA基因序列全长2240 bp,含有酶切位点、启动子、SD序列及编码738个氨基酸的开放阅读框,理论分子质量为84 ku;4种核苷酸中GC含量为47.45%、AT含量为52.55%;序列中有3个碱基发生了变化,均为无义突变,未导致其推导的氨基酸的改变;序列测定结果与GenBank中登录的序列进行比较,核苷酸和氨基酸序列的同源性除与AY873840相比分别为96.6%和92.2%外,其余均大于99%。试验成功克隆了melA基因,为进一步构建重组表达载体奠定了基础。     

中国林蛙真伪品的PCR鉴别

本研究根据GenBank发表的哺乳类SRY核酸序列和禽类EcoRI家族序列设计1对引物,对中国林蛙真伪品进行了PCR扩增,并对特征条带进行了克隆测序。结果表明,PCR扩增产物有明显的区别,中国林蛙、黑龙江林蛙、黑斑蛙和中华大蟾蜍分别扩增出约1000、250、450、750bp的特征条带,通过对中国林蛙1000bp条带的克隆序列进行BLAST比对分析,找到了一些禽类的WZ染色体上的相关基因片段。     

绒山羊细菌人工染色体BAC文库构建条件的优化

近年来,细菌人工染色体BAC文库成为应用最广泛的基因组文库之一,它以其容量大、遗传特性稳定、嵌合体少、插入片段易回收、操作简便等不可比拟的优点而被广泛应用于基因组较大的真核生物基因组研究之中。作者就细菌人工染色体BAC文库的构建条件进行了研究,用HindⅢ部分酶切绒山羊基因组,脉冲场凝胶电泳分离大片段DNA,以电洗脱法回收DNA后,与BAC载体连接,将连接产物点透析后,电转化DH10B感受态细胞,最后对转化的片段小提质粒进行NotⅠ酶切,脉冲电泳鉴定其大小。结果表明,本试验采用的方法既可获得较大的插入片段又可获得较高的转化效率,是较好的用于构建大基因组文库的方法。     

小鹅瘟病毒H株VP3基因序列分析

试验利用PCR技术从自行分离的GPV基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段,并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞,提取重组质粒经PCR和酶切鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明,VP3基因全长1605 bp,编码534个氨基酸;分子生物学分析表明所分离到的病毒为强毒株。