烟粉虱模式识别受体βGRPs的先天免疫应答

为探索烟粉虱的β-1,3-葡聚糖识别蛋白(BtβGRP)在烟粉虱先天免疫过程中的重要作用,对烟粉虱中鉴定的3个BtβGRPs基因编码的蛋白质进行结构分析,并与其它物种的23个同源蛋白进行系统进化分析,同时通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测分析球孢白僵菌侵染烟粉虱不同虫态不同时间点后BtβGRPs的时间表达模式。结果显示:经鉴定3个BtβGRPs蛋白序列均含有βGRP家族特有的保守性结构域,即糖苷水解酶活性结构域;且3个BtβGRPs独自聚在进化树的一支上,可能参与烟粉虱特有的级联路径;3个BtβGRPs基因在不同虫态和不同诱导时间点与对照相比,除BtβGRP3在卵期未表达外,均有上调表达趋势,但诱导程度不同;成虫诱导24~36 h后达到峰值,比卵和若虫稍晚,可能是由于烟粉虱成虫体表有白色蜡粉等物质,延迟了球孢白僵菌对虫体的侵染。研究表明3个BtβGRPs蛋白可能参与了烟粉虱对真菌侵染的免疫反应,有可能成为烟粉虱生防的新靶标。     

西花蓟马clip丝氨酸蛋白酶基因的鉴定与表达分析

本研究旨在鉴定西花蓟马的clip丝氨酸蛋白酶(clip-domian serine proteases,Fo CSPs)基因,分析其被球孢白僵菌侵染后的表达模式,为研究clip丝氨酸蛋白酶在西花蓟马先天免疫反应中的作用奠定基础。共鉴定出西花蓟马9个clip丝氨酸蛋白酶基因Fo CSPs,每个Fo CSPs编码的氨基酸序列都在氮端有一个发夹(clip)区域,在碳端有一个具有催化功能的丝氨酸蛋白酶区域,催化区域有3个保守的氨基酸,即组氨酸(His),天冬氨酸(Asp)和色氨酸(Ser)。系统进化树分析表明,Fo CSP215与褐飞虱NITRY19位于同一进化支上,Fo CSP261和Fo CSP236与烟草天蛾Ms POAEO,斯氏按蚊Ag CLIP和金小蜂Nv SP16P聚为一支,其余6个Fo CSPs聚为一支,并与烟草天蛾5个Ms HPs聚成的分支汇合在一起。球孢白僵菌侵染后,成虫和若虫Fo CSPs的相对表达量均为上调表达,但程度不同。对于同一基因,在若虫体内的最高相对表达量高于成虫。总之,Fo CSPs可能参与到西花蓟马应对球孢白僵菌侵染的免疫反应中,是西花蓟马生物防治的潜在靶标。     

球孢白僵菌剂量对西花蓟马偏好温度的影响

球孢白僵菌是一种对西花蓟马具高致病力的重要生防真菌。球孢白僵菌感染改变了西花蓟马的偏好温度。探讨这一现象对于提高球孢白僵菌对西花蓟马的防治效果具有重要意义。本研究分析了西花蓟马偏好温度随球孢白僵菌剂量和感染时间的变化趋势。结果表明,在各观察时间点（24～120 h,48 h除外）,感染高剂量球孢白僵菌的西花蓟马偏好温度显著低于被低剂量真菌侵染的个体。与健康西花蓟马的偏好温度（24℃±0.5℃）相比,无论是高剂量还是低剂量真菌,染菌蓟马偏好温度均随时间推移呈先下降后上升的趋势。染菌0～48 h时,蓟马的偏好温度逐渐下降。染菌后48～120 h,偏好温度回升。感染高剂量球孢白僵菌的蓟马体内真菌基因拷贝数大于被低剂量真菌感染的个体,随染菌时间的推移,差异进一步加大。本研究将为建立西花蓟马的高效防控体系提供理论支持。     

150亿孢子/g球孢白僵菌可湿性粉剂的研发及对西花蓟马的防治应用

为了研发靶标害虫为西花蓟马的球孢白僵菌杀虫剂,我们首先通过筛选、纯化和复壮获得对西花蓟马高效的真菌菌株;其次,对液-固双相发酵条件和发酵工艺进行优化;然后,改良了产品剂型和配方;最后对产品进行环境和毒性评价。结果显示该产品各项指标均符合国家标准。150亿孢子/g球孢白僵菌可湿性粉剂于2018年在国内获审批登记。喷施1800～3000 g/hm²对辣椒上西花蓟马的防效均为74%以上。推荐用量为2400 g/hm²。该产品的研发和获批登记为西花蓟马的生物防治奠定了坚实的基础。     

球孢白僵菌对小菜蛾的侵染相关基因分析

本文研究球孢白僵菌对小菜蛾的侵染相关基因,为提高球孢白僵菌的致病力提供基因靶点,从而提高球孢白僵菌对小菜蛾的防治效果。通过室内生物测定,筛选出球孢白僵菌对小菜蛾的高毒力菌株;采用新一代Solexa高通量测序技术对纯培养的球孢白僵菌和球孢白僵菌侵染小菜蛾48 h的虫菌混合样品分别进行转录组测序,筛选差异表达基因;结合生物信息学方法分析差异表达基因涉及的基因功能及细胞通路等;应用荧光定量PCR技术验证20个基因的差异表达。转录组测序结果显示,纯培养的球孢白僵菌与侵染小菜蛾幼虫48 h的球孢白僵菌转录组对比分析共得到8383个差异表达基因,其中显著差异表达基因716个,上调基因350个,下调基因366个。本研究筛选获得的差异表达基因,特别是上调表达的基因可能与球孢白僵菌对小菜蛾的侵染有关。GO二级分类表明,DEGs被注释到26个GO term中,包括11个生物学过程,8个细胞组分和7个分子功能;Pathway分析表明共有12个Pathway,93个上调基因和61个下调基因参与了这些途径。深入分析发现,胞外丝氨酸富集蛋白、细胞壁蛋白、胞外双加氧酶、铁转运蛋白、细胞壁半乳糖抗原蛋白等在侵染过程中与毒力相关的基因均具有显著性差异表达。研究结果为阐明球孢白僵菌对小菜蛾的侵染机制提供了基础。     

参与烟粉虱免疫反应的clip丝氨酸蛋白酶基因分析

为了解参与烟粉虱免疫反应的clip丝氨酸蛋白酶(clip-domain serine proteases in Bemisia tabaci,Bt CLIPs)基因,对已鉴定的8个Bt CLIPs基因编码的蛋白进行序列分析,与冈比亚按蚊、家蚕、黑腹果蝇、烟草天蛾4种模式昆虫的同源蛋白进行系统进化分析,并通过q RT-PCR检测球孢白僵菌侵染烟粉虱4龄若虫后Bt CLIPs的时间表达模式。结果显示,8个Bt CLIPs基因均为含有CLIPs结构域的丝氨酸蛋白酶基因;Bt CLIP19、Bt CLIP20和Bt CLIP21独自聚在进化树的一支上;其它Bt CLIPs均与4种模式昆虫中的1种或多种同源蛋白聚在一起;与对照相比,8个Bt CLIPs基因受球孢白僵菌侵染后在不同时间的相对表达量均上调,但诱导程度不同,48 h的相对表达量达最高,其中Bt CLIP19上调表达最明显,为对照组的71倍。研究表明,8个Bt CLIPs可能参与烟粉虱对真菌侵染的免疫反应,并成为烟粉虱生物防治的新靶标。     

一株侵染柑橘木虱的球孢白僵菌的分离及鉴定

从柑橘木虱虫体分离得到一株具有强致病性的虫生真菌GZMS-28,本文测定了该菌株对柑橘木虱的致病性,并分析了其rDNA ITS基因序列。试验结果表明,该菌株对柑橘木虱具有较强的致病性,浓度为1.0×108个/mL的分生孢子悬浮液处理柑橘木虱成虫7d后,其校正死亡率达到95.7%。菌株GZMS-28的培养特征与白僵菌属球孢白僵菌较为一致,其rDNA ITS序列与GenBank中白僵菌属多个球孢白僵菌菌株的对应序列相似性达到99%以上,因此将菌株GZMS-28鉴定为球孢白僵菌Beauveria bassiana。     

球孢白僵菌与食诱剂对西花蓟马的联合作用

为发展球孢白僵菌和食诱剂联合应用对西花蓟马的防控技术,本研究在室内测定了不同条件下食诱剂对球孢白僵菌分生孢子萌发的影响,在温室测定了食诱剂相对球孢白僵菌接种装置不同位置对球孢白僵菌分生孢子萌发率、蓟马引诱量和装置外蓟马侵染量的影响。室内结果表明：开放空间下,孢子萌发率随食诱剂距球孢白僵菌的距离增加而增加,当距离为20 cm时,孢子萌发率与对照无差异。温室结果表明：食诱剂放置于接种装置内时,孢子萌发率为23.4%,显著低于食诱剂距装置0 cm(42.9%)、10 cm(43.9%)和20 cm(46.5%)三个处理以及对照（56.3%）。当食诱剂距接种装置0 cm时,接种装置吸引到的蓟马数量最高;而食诱剂置于接种装置内时,装置对蓟马的引诱效果最差。装置外蓟马侵染效果显示：食诱剂距接种装置10 cm时,装置周围植株上蓟马获菌量最高,且显著高于其他处理。同时,随着时间的延长,接种装置周围植株上蓟马获菌量逐渐增加。球孢白僵菌和食诱剂联合应用可建立起“诱集-侵染-传播”系统,为西花蓟马新型防治技术研发奠定基础。     

五株病原真菌对桃小食心虫的致病力

为筛选桃小食心虫高致病性菌株,以在山西省自然感病的桃小食心虫越冬幼虫上分离获得的5株病原真菌为材料,研究各菌株感染桃小食心虫幼虫的症状、对寄主的致死率,以及与菌株毒力相关的胞外类枯草杆菌蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶的活性变化,并评价其生物防治潜力。5个菌株在寄主上的感病症状和致死率有显著差异,感病后10天,球孢白僵菌BbTST05对寄主的致死率最高,为89.3%,其类枯草杆菌蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶3种酶活性均最大;粉棒束孢IfTSL02对寄主的致死率及其蛋白酶、几丁质酶活性次之;尖孢镰孢菌的FoTSL01、FoTSL03和FoTSL04菌株对桃小食心虫的致死率均低于61%,3种胞外酶的活性也较低。因此,球孢白僵菌BbTST05和粉棒束孢IfTSL02可用于桃小食心虫的防治。     

不同温度下4株白僵菌对西花蓟马的致病力

本文测定了4株白僵菌在18、22、26、30、34 ℃ 5个温度下对西花蓟马成虫和若虫的毒力, 结果表明：白僵菌JMS、HS、MBb、RSB 4个菌株在这5个温度下对西花蓟马成虫均具有很高的致病力,绝大多数西花蓟马在5 d左右死亡,致死率均在97％以上,多数为99％～100％,致死中时为1.4～3.2 d,白僵菌RSB菌株对西花蓟马成虫的致死中时最短,在30 ℃下,仅为1.4 d。在各温度下供试菌种对西花蓟马若虫的致病力明显低于对西花蓟马成虫的致病力,其致死率一般在90％～99％,致死中时也相对较长。     

球孢白僵菌对西花蓟马成虫的毒力及体表侵染的扫描电镜观察

本文在室内测定球孢白僵菌Beauveria bassiana CYT4菌株对西花蓟马Frankliniella occidentalis成虫的致死作用,并电镜观察分生孢子在西花蓟马成虫体表的侵染过程。结果表明：白僵菌的致死率随孢子浓度的增加而增加,1×109、1×108、1×107和1×106孢子.mL-1的孢悬液接种试虫第6d的致死率分别为83.57%、66.08%、49.78%和20.22%;0.04μL.mL-1和0.06μL.mL-1的多杀菌素与1×108孢子.mL-1白僵菌孢悬液混合后对试虫接种第5d的致死率分别为89.42%和95.76%,而单独施用菌液为58.19%,单独施用多杀菌素仅为45.55%和61.33%,表明二者混合能提高对西花蓟马成虫的致死率。扫描电镜观察发现,经白僵菌孢悬液处理的西花蓟马成虫虫体,在触角基节、复眼、足部褶皱区、刚毛窝、翅、产卵器和各体节连接处均有大量孢子附着和萌发,但腹部孢子量很少,尤其在节间膜处几乎无孢子;孢子在1h时即附着在体表,12h时已萌发,36h时有穿透体壁现象,48h后整个虫体被菌丝包被。     

白僵菌对西花蓟马若虫的致病力和对巴氏钝绥螨的影响

本文测定了5株球孢白僵菌Beauveriabassiana对西花蓟马Frankliniellaoccidentalis1龄若虫的致病力,获得3株毒力较高的菌株：TL．7、sz．15和RSB,在1×10^8孢子．mL^-1浓度下的西花蓟马l龄若虫死亡率分别为90．8％、92．5％和100％;结合测定的致死时间与致死浓度,得出菌株RSB为最优菌株（LT50为2．383d,LC50为1．53X10’孢子．mL^-1）。以西花蓟马1龄若虫为猎物,测定菌株RSB对其天敌巴氏钝绥螨Amblyseiusbarkeri的影响。结果表明：用菌株RSB（1×10’孢子．mL^-1）处理的巴氏钝绥螨可发育为成螨;发育历期、雌成螨寿命和平均每雌每天产卵量分别为5．9d、33．850d和1．78粒,与对照均差异不显著,说明西花蓟马的高效白僵菌菌株RSB对其天敌巴氏钝绥螨不存在显著的负面影响。本文结果表明白僵菌可在田间与巴氏钝绥螨协同控制重大外来入侵害虫西花蓟马。     

球孢白僵菌DNA甲基转移酶基因Dim-2的克隆及其表达分析

本研究运用RACE技术,从球孢白僵菌中克隆出完整的DNA甲基转移酶基因Dim-2的编码区序列。该基因c DNA全长4021 bp,5′端非翻译区283 bp,3′端非翻译区303 bp,开放阅读框(ORF)3429 bp,编码1142个氨基酸。蛋白理论分子量为128 k D,理论等电点为6.13。结构域分析显示,该基因编码蛋白含有1个BAH结构域和合成5-甲基胞嘧啶的活性区域。Real-time PCR与HPLC检测表明,球孢白僵菌DNA甲基化程度会随着其生长发育的变化而不断改变。结果显示,球孢白僵菌Dim-2基因的转录表达量与基因组DNA的5-甲基胞嘧啶百分含量在菌体培养初始产孢阶段(即培养第7 d),均出现了1个低谷。这可能意味着球孢白僵菌Dim-2基因所引起的DNA甲基化与其生长发育之间具有内在的联系。本研究将为进一步探索DNA甲基化在虫生真菌生长发育中具体功能机制奠定基础。     

球孢白僵菌菌丝生长中HsbA基因的表达量变化

球孢白僵菌是一种具有杀虫潜力的生防真菌,菌丝是其重要的结构单位,而疏水蛋白被认为参与了气生菌丝的生长过程。本文以球孢白僵菌疏水表面结合蛋白编码基因HsbA为检测对象,利用荧光定量PCR方法研究了该基因在液生菌丝和气生菌丝中的相对表达量,结果表明,HsbA基因在气生菌丝中的相对表达量显著高于液生菌丝。基于以上结果,我们推断,HsbA基因在气生环境下的上调表达可能会增加其编码蛋白的总量,从而对球孢白僵菌气生菌丝的生长发育起到调控作用。研究结果不仅为菌种的遗传改良提供了一个切入点,也对菌株的商业化生产有一定的指导意义。     

通过抑制消减杂交技术分离球孢白僵菌热激响应基因

高温等逆境因素会影响生防真菌——球孢白僵菌Beauveria bassiana的田间应用效果。为了深入了解生防真菌热胁迫响应的分子机理,本研究采用抑制消减杂交技术构建了球孢白僵菌热胁迫下的差异表达cDNA文库,筛选出28个热激响应上调基因。通过基因比对分析,大部分基因与已知功能基因如物质运输、基础代谢及胁迫响应类基因等具高度同源性。从中挑选12个基因利用荧光实时定量PCR分析了菌株在40℃下热激15、30、60、120 min后的相对表达水平,结果显示这些基因的表达模式随热激时间和基因不同而异,显示菌体在热激的不同阶段依次启动不同的应激方案来应对热激胁迫。这些热激响应基因为揭示球孢白僵菌的耐热机制和通过遗传改造提高菌株耐热力奠定基础。     

防治西花蓟马的球孢白僵菌菌株筛选及耐热性测定

采用浸虫法分别测定了191株不同地理来源的球孢白僵菌对西花蓟马初羽成虫的毒力,筛选出61株高毒力的菌株,其LT₅₀均小于4.1 d;对该61株球孢白僵菌用48 ℃热胁迫的方法进行耐热性的测定,将分生孢子丧失50%活力所需的时间,定义为LT₅₀,作为耐热性的指标。结果表明,所测61株球孢白僵菌经受热胁迫后LT₅₀平均值为34.28 min(6.94～53.67 min),其中有10株菌LT₅₀大于45 min,作为耐热性较强的菌株,将该10株菌继代培养5代,继续进行耐热性测定,发现其中6株菌在继代培养过程中耐热性出现了退化,有4株菌耐热性保持稳定,分别为菌株XJWLMQ-49、XJWLMQ-32、JLGZL-14和SCWJ-9,因此,该4株菌具有开发和应用潜力。     

FpStuA参与假禾谷镰孢的产孢和致病性

 假禾谷镰孢是一种土传真菌,其引起的小麦茎基腐病已成为威胁我国小麦生产的重要病害。APSES蛋白是真菌中保守存在的一类转录因子,参与多种细胞生理过程。本研究,我们在假禾谷镰孢中鉴定到StuA同源蛋白FpStuA。qRT-PCR分析发现FpStuA在假禾谷镰孢分生孢子和侵染阶段诱导表达。通过PEG介导的原生质体转化方法获得3个FpStuA基因缺失的突变体。与假禾谷镰孢野生型菌株相比,Δfpstua突变体的生长速度明显减慢,气生菌丝减少;分生孢子的产生比野生型减少70%,且Δfpstua突变体分生孢子变短、分隔减少;Δfpstua突变体对大麦叶片、小麦胚芽鞘和小麦根的致病性均显著降低,脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)合成明显减少。综上结果,转录因子FpStuA对假禾谷镰孢的生长、产孢和致病性都非常重要。     

球孢白僵菌SJ-05几丁质酶基因的克隆与序列分析

几丁质酶在昆虫真菌侵染寄主过程中起着重要的作用。本文对采自内蒙古准格尔旗沙棘木蠹蛾的球孢白僵菌菌株SJ-05进行了几丁质酶的基因分析,从中克隆了几丁质酶Bbchit基因,得到了重组质粒pMD19-T/chit。测序结果表明,Bbchit基因核苷酸序列阅读框架全长为1047 bp,编码348个氨基酸,推测分子量为36.924 ku,等电点为5.94。氨基酸序列比对结果表明,与球孢白僵菌Bb0062菌株（AAN41259.1）的氨基酸序列相似性最高,为99.71%。     

球孢白僵菌对松墨天牛的致病力及其与花绒寄甲的相容性

为探明昆虫病原真菌球孢白僵菌Beauveria bassiana与天敌昆虫花绒寄甲Dastarcus helophoroides的相容性,观察4株球孢白僵菌菌株的生长性状、产孢量以及孢子萌发率,并选用Bb3275和Bb202菌株测定其对松墨天牛Monochamus alternatus的致病力以及对花绒寄甲的毒力;同时在模拟环境条件下,分别用Bb3275和Bb202菌株的孢子悬浮液先侵染松墨天牛幼虫,再按1∶1比例将花绒寄甲与受侵染的松墨天牛置于同一环境下饲养,观察花绒寄甲的死亡率。结果显示,孢子悬浮液浓度为1×10⁶孢子/mL至1×10⁸孢子/mL时,Bb3275菌株和Bb202菌株对松墨天牛幼虫和成虫的致病力与对照组相比均有显著差异;经4种浓度Bb3275和Bb202菌株侵染花绒寄甲幼虫和成虫15 d后,仅在高浓度1×10⁸孢子/mL时表现出轻微致死作用,但花绒寄甲的存活率均高于85.00%;模拟条件下,松墨天牛幼虫校正死亡率均在80.00%以上,而同环境下花绒寄甲幼虫和成虫均表现出良好的活力,且侵染率为0。表明球孢白僵菌和花绒寄甲之间具有很好的相容性,可以同时应用于松墨天牛的生物防治。     

Mrhox3影响罗伯茨绿僵菌产孢和抗逆能力的研究

罗伯茨绿僵菌作为一种昆虫病原真菌,已在害虫生物防治中得到应用。Homeobox家族基因在真菌无性繁殖过程中具有重要作用,但是其在昆虫病原真菌中的功能尚不清楚。qRT-PCR结果显示homeobox家族基因Mrhox3在产孢阶段和分生孢子阶段高水平表达。通过基因敲除与回补研究其功能,结果表明敲除Mrhox3不影响菌株营养生长和致病性,但是显著降低菌株的产孢能力。进一步研究显示敲除Mrhox3显著下调关键调控因子abaA和wetA等多个产孢相关基因的表达水平。敲除Mrhox3促进分生孢子萌发,并显著增强分生孢子对紫外胁迫和热激胁迫的耐受力。本研究将为进一步揭示罗伯茨绿僵菌的产孢机制和分生孢子抗逆机制奠定基础。