人工培育蝉花的活性成分含量测定

[目的]明确人工蝉花的活性成分含量。[方法]用微波法提取人工蝉花和野生蝉花的活性成分,用高效液相色谱法测定虫草素和腺苷含量,用高碘酸钠法测定虫草酸含量,用苯酚-硫酸法测定虫草多糖含量。[结果]人工蝉花的虫草酸含量和野生蝉花相当,虫草多糖含量则高达110.09mg/g;腺苷含量较野生蝉花低,虫草素未能检出,但4种活性成分总量是野生蝉花的1.55倍。[结论]从活性成分含量看,人工蝉花可代替野生蝉花,但还需进行进一步试验。     

1株野生蝉虫草的鉴定及其胞内和胞外多糖抗肝癌活性比较

【目的】对1株野外采集的蝉虫草进行分离和鉴定，分析比较其发酵菌丝体胞内和胞外多糖的抗肝癌细胞HepG-2活性及多糖的组成。【方法】通过形态学特征和ITS序列分析，对供试菌株进行鉴定；采用MTT法、细胞划痕试验，比较供试菌株菌丝体胞内和胞外多糖对人肝癌细胞HepG-2的抑制活性以及对人正常肝细胞LO2的毒性，并通过高效液相色谱法和凝胶渗透色谱法，比较分析2种多糖的成分及分子质量分布。【结果】根据菌株形态学特征和ITS序列分析，供试菌株为蝉虫草Cordyceps cicadae；其胞内和胞外多糖均可极显著抑制HepG-2细胞活性（P<0.01），半数抑制浓度（IC₅₀）值分别为3.23和0.45 mg/mL，细胞迁移率分别为38.72%和24.79%，提示胞外多糖比胞内多糖具有更强的抗肝癌细胞HepG-2活性；且2种多糖对人LO2细胞均无明显毒性；进一步分析发现，胞外多糖中半乳糖醛酸的含量是胞内多糖的23.53倍，其分子质量的94.1%集中在19.1～85.0 ku，胞内多糖中核糖是其特征性单糖，高分子质量多糖（>250.0 ku）分布占比明显高于胞外多糖。【结论】野生蝉虫草菌株发酵所产胞外多糖的抗肝癌细胞HepG-2活性较胞内多糖强，二者在单糖组成和分子质量分布上存在明显差异。     

江苏省天王镇磨盘山金蝉花分离菌株鉴定及系统发育分析

蝉花是一种名贵的传统中药,其分离物多样性丰富,不同菌株的药理作用及生物活性物质含量差异明显,因此,分离物的确证是蝉花研究的关键环节.对江苏省句容市天王镇磨盘山采集的金蝉花标本分离物进行菌落形态、产孢结构观察,并依据ITS区序列进行系统发育分析,确定为蝉棒束孢菌的不同地理株.该研究对于扩大传统中药资源,进一步深入研究该菌株的药理作用及活性成分具有重要意义.     

浙江天目山蝉花虫草的分离及基质栽培

在浙江天目山竹林土壤感染的竹蝉若虫上分离获得了一株蝉花虫草TM06菌株,分析了TM06菌株ITS序列,采用小麦为基质建立了TM06菌株的基质栽培技术。结果表明,分离获得的TM06菌株与蝉花虫草亲缘关系最近,以小麦为基质可培养蝉花虫草TM06的子实体,添加5%的蝉蛹粉可显著提高子实体产量,每瓶子实体干重平均为11.61 g。     

高产活性成分蛹虫草菌株的筛选

对7株不同的蛹虫草菌株进行比较分析,以期筛选得到高产活性成分的优质蛹虫草菌株.通过对7株蛹虫草菌株子实体的形态、产量、子实体中活性成分(虫草素、虫草酸、腺苷、虫草粗多糖)的含量等进行对比研究.结果 表明,菌株H05综合品质最好,子实体产量可达20.4g·瓶-1,虫草素含量为0.523％、腺苷含量为0.556％、虫草酸含...     

蝉花虫草多糖脱蛋白研究

蝉花虫草粗多糖中杂有蛋白、核酸、酚类等物质,给多糖的分离纯化带来许多干扰,为了排除杂质干扰,获得较为纯净的多糖组分,采用Sevag法和大孔树脂吸附法相结合对蝉花虫草粗多糖进行了脱蛋白试验。结果表明:采用大孔树脂法或Sevag法均不能完全去除粗多糖中的游离蛋白,两种方法结合脱蛋白除杂效果较为理想,蛋白去除率达96%以上。初步分离获得大孔树脂水相洗脱部位和20%乙醇洗脱部位2种主要多糖组分。综合分析,先用Sevag法脱蛋白2~3次,再用大孔树脂AB-8吸附分离,或先大孔树脂AB-8吸附分离获得不同多糖组分,再用Sevag法辅助脱蛋白1~2次,两种方法去除蝉花虫草粗多糖中蛋白的效果均较好。     

薏苡种仁内生真菌的分离及其抗菌活性

为筛选薏苡种仁内生真菌的抗菌活性,采用组织分离法,从禾本科黍亚科蜀黍族薏苡种仁中分离内生真菌,采用菌饼法筛选其抗菌活性。通过5．8 S ITS 分子系统学鉴定菌种,高效液相色谱法（HPLC）分析鉴定菌种发酵液正丁醇提取物次的生代谢产物。结果表明：分离共获得23株薏苡种仁内生真菌,其中,有弯孢霉属、链格孢属、砖孢属、茎点霉属、灰软盘菌属、稻黑孢属、玉蜀黍赤霉属、曲霉属及其他真菌。57％的菌株至少对测试菌株中的1种具有抗菌活性,且 GZR19号菌株具有广谱抗菌活性并鉴定为1种茎点霉（Phoma sp ．）,其发酵液的次生代谢产物在该色谱条件下主要有4种物质含量较高,其中可能存在具有抗菌活性的化合物。     

北冬虫夏草发酵液中虫草素和腺苷含量的HPLC分析

试用高效液相色谱法同时检测了5株北冬虫夏草菌株发酵液中虫草素和腺苷的含量,并系统地研究了各种发酵条件对虫草素和腺苷含量的影响.结果表明,虫草素和腺苷在所设色谱条件下得到了很好的分离,二组分的线性关系良好,回收率满意,其中虫草素峰保留时间为11.443min,腺苷峰保留时间为9.054min;虫草素的回收率为103.22%,RSD=4.4%,腺苷的回收率为98.42%,RSD=3.2%;虫草素和腺苷的线性范围分别为0.49～98μg/mL,0.46～92μg/mL.5株待测菌株发酵液中的菌丝干重第5天都达到了最大值,其中Cordycepsmilitaris G5124菌株的虫草素含量第9天达最大值,腺苷含量第1天达最大值.试验结果还表明,不同菌株发酵液中的虫草素和腺苷含量具有明显差异,这可能与菌株本身的遗传特性有关.其中C.militaris G（04）5f菌株的虫草素含量最高,可用作发酵生产虫草素的高功能菌株,进一步试验表明,当起始pH值为9时该菌株的虫草素含量达到最高.     

基于rDNA ITS序列和ERIC-PCR研究虫草真菌无性分离物的遗传多样性

以24株虫草无性分离物和1个蛹虫草子实体为材料,利用ITS序列分析和ERIC-PCR方法对这些材料进行了遗传多样性分析。结果表明:ITS序列分析表明蝉花的无性分离物4645(菌生轮枝菌Lecanicillium fungicola)与蝉花的无性分离物4644和4646及蛹虫草的无性分离物亲缘关系较近,而冬虫夏草无性分离物4634及4636则为膨大弯颈霉Tolypocladium inflatum;蛹虫草Cordyceps militaris无性型与蝉花Cordyceps cicadae无性型(4644、4646)及无性分离物4645聚成一族,而冬虫夏草分离物4634及4636与冬虫夏草的关系较近,聚成另一族。ERIC-PCR分析结果表明,在相似性系数为0.76时,上述分离物分成4组,即1)L.fungicola;2)T.inflatum;3)C.cicadae;4)C.militaris。上述结果表明虫草无性分离物具有丰富的遗传多样性。同时,本研究检测了上述无性分离物胞外液中虫草素的含量,发现所有蛹虫草无性分离物(除1811之外)的胞外液中均含有虫草素,但蝉花和冬虫夏草的无性分离物(4634、4636、4644、4645和4646)胞外液中的虫草素产量极低,甚至无法检测出。     

不同食用方式下蝉花麦角甾醇、虫草素、腺苷和多糖的比较

开展对蝉花不同食用方式下其子实体、菌核、浸提液和浸提后蝉花,进行麦角甾醇、虫草素、腺苷和多糖的定量研究,以期得出有实用价值的差别性数据,为对蝉花进一步的综合利用提供理论数据。不同食用方式分为直接食用蝉花粉末、水煮后制剂和水煮后蝉花整食。根据市场上将蝉花质量高低按子实体大小划分,分别开发食用蝉花子实体、蝉花菌核、蝉花浸提液和浸提后蝉花。研究结果表明:(1)麦角甾醇。子实体中为0.34±0.05 mg·g~(-1),浸提蝉花中为0.31±0.03 mg·g~(-1),菌核中为0.07±0.01 mg·g~(-1),浸提液中未检出。(2)虫草素。子实体中为0.54±0.04mg·g~(-1),浸提蝉花中为0.28±0.02 mg·g~(-1),浸提液中为0.37±0.03 mg·g~(-1),菌核中为0.14±0.02 mg·g~(-1)。(3)腺苷。子实体中为0.61±0.04 mg·g~(-1),浸提蝉花中为0.35±0.05 mg·g~(-1),菌核中为0.30±0.06 mg·g~(-1),浸提液中为0.45±0.04 mg·g~(-1)。(4)多糖。菌核中为(14.84±1.79)%,浸提蝉花中为(13.34±0.95)%,子实体中为(13.17±1.02)%,浸提液中为(9.61±0.71)%。结果显示,蝉花子实体、菌核与浸提前后蝉花活性成分存在差异。     

几种虫草无性型及其相关真菌SOD比较研究

采用氮蓝四唑光照法比较了几种虫草无性型及其相关真菌的SOD酶比活力及粗酶含量,同时应用聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行了活性显示.结果表明,不同菌种,SOD酶谱差别较大,而分离自冬虫夏草的HS系列菌株和虫草簇孢SIN-1菌株图谱较接近;蝉拟青霉(PC-1)干重的SOD酶比活力最高,达874.3 U·g-1,其次是细脚拟青霉(PT-1)干重的为537.6 U·g-1,HS-1菌株干重的SOD酶比活力为466.9 U·g-1.供试菌株的粗酶含量占干重的百分比在0.73%～2.50%之间.综合酶比活力和含量考虑,蝉拟青霉和HS-1菌株在抗氧化方面具有较好的开发应用前景.     

蝉棒束孢交配型基因MAT的群体分布特征

【目的】探明药用真菌蝉棒束孢Isaria cicadae的交配型基因MAT的群体分布特征及其对蝉花 有性生殖的影响，为提高蝉花的生殖率提供参考。【方法】从全国7省12市采集的100份蝉花标本中分离培养菌种，经形态观察、显微鉴定和ITS序列分析，获得各蝉花的无性型菌株；从各菌株DNA中克隆并分析MAT1-1-1和MAT1-2-1序列的结构和分布特征。【结果】在100株菌株中，13株菌株仅有1MAT1-1-1，79株菌株仅有MAT1-2-1，8株菌株兼有2个序列。2MAT1-1-1（缺HMG ɑ-box）极少与1MAT1-1-1共存，常与MAT1-2-1伴存，但FJDH7和FJDH9菌株同时存在1MAT1-1-1、2MAT1-1-1和MAT1-2-1序列。聚类分析未发现MAT基因的地域分布相关性。【结论】群体中不同蝉棒束孢菌株的MAT基因有4种可能，兼有3种序列菌株的检出率极低，推测与蝉花有性生殖概率极低的现状有关。     

虫草属真菌中主要活性成分含量的比较

采用高效液相色谱法和苯酚硫酸法分别检测北冬虫夏草和冬虫夏草中虫草素和虫草多糖含量。HPLC色谱条件为：色谱柱为Waters NOVA—PAK C18（3,9mm×300mm,4μm）;流动相为水：甲醇=90：10;流速1．00mL·min^-1,检测波长260nm;虫草多糖检测条件为：在待测样品中加入硫酸10mL,显色1min后,在酶标仪上用490nm波长测定样品的吸光值。结果表明：高效液相色谱法的检测虫草素的回归方程为Y=-7．066×10^6＋3.206×10^6X,R=0．9999（n=3）,虫草素的平均含量为北冬虫夏草子实体1．137％,菌丝体0,7162％．冬虫夏草中0．000523％,苯酚硫酸法检测虫草多糖的回归方程为Y=0．09889＋1．161X,R=0．9964（n=7）,虫草多糖在不同材料中的含量分别为北虫草子实体3．35％,菌丝体3．05％,冬虫夏草7．83％。该研究为进一步研究冬虫夏草替代品奠定了基础。     

不同培养基人工培育蝉花中有效成分的比较

分别以麦仁和活体蚕蛹为培养基栽培蝉花获得孢梗束,对其有效成分进行比较。结果表明:以蚕蛹为基质感染蝉花菌株,获得的蝉花孢梗束(CY)中粗多糖、腺苷、N~6-(2-羟乙基)腺苷、海藻糖、甘露醇、葡萄糖、尿苷、鸟苷含量分别为1.17%、1.40 mg/g.0.2 mg/g、9.95%、8.16%、1.90%、2.58 mg/g、0.90 mg/g;CY中多糖由岩藻糖、阿拉伯糖、甘露糖3种单糖组成,岩藻糖:阿拉伯糖:甘露糖摩尔比=1:2.03:16.91;与麦仁培养基栽培获得的蝉花孢梗束(DM)相比,CY中腺苷、海藻糖和甘露醇含量明显高于DM,粗多糖及N~6-(2-羟乙基)腺苷含量略低于DM。由此可见,不同的培养基在蝉花代谢产物的种类及含量上存在一定程度的差异。     

银杏内生真菌的分离纯化及抑菌性的鉴定

采用组织分离法从银杏(Ginkgo biloba)健康组织中分离得到25株内生真菌,根据菌株在PDA培养基上的培养特征,5株被鉴定为链孢霉菌属、4株为酵母属、4株为曲霉属,3株为毛霉属、3株为青霉属,2株为根霉属,1株为简梗孢霉属,3株分离菌株不产孢子。测定25株内生真菌对3种受试指示菌的抑制作用,共筛选得到11株至少对一种指示菌的生长有抑制作用的菌株,对抑菌活性较强的菌株进行形态学和显微分析鉴定。     

蛹虫草多糖的抗氧化活性研究

【目的】研究蛹虫草多糖的体内外抗氧化活性,为蛹虫草多糖的开发利用提供依据。【方法】以蛹虫草为原料,采用水提醇沉法制备蛹虫草粗多糖（cordyceps militaris polysaccharide,CMPs）,再以二乙氨基乙基纤维素52（DEAE cellulose 52,DEAE-52）柱色谱法进行分离纯化,通过苯酚 硫酸法测其总糖含量;测定蛹虫草多糖对羟自由基、超氧阴离子、ABTS·和DPPH·的清除作用;建立D 半乳糖致小鼠亚急性衰老模型,进一步研究CMPs的体内抗氧化活性。【结果】纯化后的蛹虫草多糖总糖含量为82.57%;体外抗氧化活性结果表明,蛹虫草多糖（CMPs）对羟自由基、超氧阴离子、ABTS·和DPPH·均有良好的清除作用,且呈现良好的剂量效应关系,其半数有效质量浓度（EC₅₀）分别达到1.912,2.153,1.612和2.058 mg/mL。体内抗氧化活性结果表明,CMPs能够显著提高衰老模型小鼠血清和肝脏组织中的T-SOD、CAT和GSH-Px活力,同时能显著降低MDA含量,并且呈现良好的质量浓度依存关系,尤其是在高剂量时可以使衰老模型小鼠血清和肝脏组织中相关抗氧化指标恢复到或接近正常水平,极显著降低机体的MDA含量。【结论】蛹虫草多糖（CMPs）具有良好的体内外抗氧化活性,具有开发成天然抗氧化剂的潜能。     

乌岩岭自然保护区的虫草研究

该文对乌岩岭自然保护区的7种虫草类真菌(蝉花、细脚棒束孢、鲜红虫草、发丝线虫草、长座线虫草、小蝉草、蜂头线虫草)进行调查,并对几种虫草及其无性型进行讨论,为乌岩岭自然保护区虫草的进一步开发利用提供依据。     

蚕蛹虫草中虫草素和腺苷含量影响因素研究

以双蒸水为溶剂,用反相高效液相色谱-紫外检测法测定蚕蛹虫草样品中虫草素和腺苷含量,并用该方法测定了19-3、17-3、MS、1-1以及1-Y等12种不同虫草菌株栽培的蚕蛹虫草、不同品质的蚕蛹虫草以及蚕蛹虫草不同组织中的虫草素和腺苷的含量。结果表明:1-Y菌株的虫草素和腺苷含量均最高,质量分数达15.45 mg/g和4.40 mg/g;不同品质的蚕蛹虫草中虫草素则以感染而未出草的僵蚕最高;蚕蛹虫草的僵蚕体对虫草素的富集能力高于子座,蚕蛹虫草的子座对腺苷的富集能力高于僵蚕体。该结果可对探求高虫草素含量和高腺苷含量的虫草材料提供理论依据。     

蛹虫草子囊孢子单孢分离与交配型基因鉴定

[目的]明确蛹虫草亲本和子囊孢子单孢菌株交配型基因类型.[方法]以自主分离保存的CM1901菌株新鲜子实体为材料,采用孢子弹射和梯度稀释培养法,获得子囊孢子单孢菌株.采用PCR方法对蛹虫草的亲本及单孢菌株的交配型基因进行鉴定.[结果]获得102个子囊孢子单孢菌株.亲本菌株同时含有MAT1-1和MAT1-2两种交配型;102株单孢分离株中,仅含MAT1-1交配型菌株57株,仅含MAT1-2交配型菌株24株,另外21株为亲本型(同时含有MAT1-1和MAT1-2),MAT1-1∶MAT1-2为78∶45.[结论]分离获得102个蛹虫草子囊孢子单孢菌株,发现这些单孢菌株交配型有3类,且MAT1-1∶MAT1-2比例为78∶45,与理论值1∶1有较大差值,所以蛹虫草不属于典型的二极性异宗配合型子囊真菌.     

水葫芦生防真菌Cercosporasp.FJ24的分离、鉴定及其分子生物学研究

从福建省得到被致病菌强烈感染的水葫芦植株,从中分离到致病菌菌株FJ24。形态学鉴定表明,该致病菌属于尾孢属。对该菌株的ITS区、EF-1、β-Tub、His-H3基因进行PCR扩增,测序结果显示其与目前已经分离、发现的多种尾孢属水葫芦致病菌存在着99%以上的序列相似性,可以认为其属于半知菌类（无性类）、丝孢纲、丝孢目、淡丛梗孢科、尾孢属的Cercospora piaropi。