棘胸蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌的分离鉴定及其感染的病理损伤

2016年4月四川雅安一棘胸蛙(Quasipaa spinosa)养殖场暴发一种临床特征表现为白内障、体表溃疡和神经症状的传染病。为明确此次流行病病因,本研究进行了病原菌分离、人工感染、分离菌理化特性与16S rDNA基因序列分析。结果从患病蛙肝、脾、肾中分离到一株G^-短杆菌(CM160701);将其腹腔注射感染健康棘胸蛙表现出与自然发病蛙相似症状。该菌的LD₅₀为1.19×10⁶ cfu·只^-1;通过理化特性与16S rDNA基因序列分析鉴定分离菌为脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica);其对氟苯尼考敏感,对恩诺沙星、多西环素、阿莫西林等多种药物耐受。病理组织学观察发现,其感染对全身多组织器官造成损伤,表现出明显的变性、坏死和炎症反应,尤以脑、肝、脾、心和肾损伤严重。该研究证实了脑膜炎败血伊丽莎白菌是本次疫情的病因,其感染引起棘胸蛙全身性损伤导致多组织器官功能障碍而死亡。     

黄喉拟水龟摩氏摩根菌的分离鉴定及系统发育分析

从广西某黄喉拟水龟(Mauremys muticaCantor)养殖场发病的黄喉拟水龟的肝、肺分离到一致病性的菌株(HX081027),经人工感染实验证实其为该病的病原菌。对该菌的形态、生理生化进行分析,试验结果与报道的摩氏摩根菌一致,表现为革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌,无荚膜及芽孢,葡萄糖产酸产气,接触酶、脲酶、苯丙氨酸脱氨酶和鸟氨酸脱羧酶阳性,氧化酶、脂酶、DNA酶和赖氨酸脱羧酶阴性,甲基红阳性,VP反应阴性,MR阳性等特征。采用扩增细菌16S rDNA的通用引物对该菌的16S rDNA基因进行PCR扩增、克隆测序,得到1条长度为1506bp的核苷酸序列(GenBank登录号为FJ858185)。以该菌16S rDNA序列和GenBank数据库内同源性较高的细菌16S rDNA序列进行同源性比对分析和构建系统发育树,结果显示分离菌HX081027与摩氏摩根菌属内相关菌株的同源性在98.8%~99.6%,且在系统发育树上与来源于鱼类的M.morganiiJCM1672聚为一支,结合形态及生理生化特点将其确定为摩氏摩根菌(Morganella morganii)。     

黄喉拟水龟摩氏摩根菌的分离鉴定及系统发育分析

从广西某黄喉拟水龟(Mauremys muticaCantor)养殖场发病的黄喉拟水龟的肝、肺分离到一致病性的菌株(HX081027),经人工感染实验证实其为该病的病原菌。对该菌的形态、生理生化进行分析,试验结果与报道的摩氏摩根菌一致,表现为革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌,无荚膜及芽孢,葡萄糖产酸产气,接触酶、脲酶、苯丙氨酸脱氨酶和鸟氨酸脱羧酶阳性,氧化酶、脂酶、DNA酶和赖氨酸脱羧酶阴性,甲基红阳性,VP反应阴性,MR阳性等特征。采用扩增细菌16S rDNA的通用引物对该菌的16S rDNA基因进行PCR扩增、克隆测序,得到1条长度为1506bp的核苷酸序列(GenBank登录号为FJ858185)。以该菌16S rDNA序列和GenBank数据库内同源性较高的细菌16S rDNA序列进行同源性比对分析和构建系统发育树,结果显示分离菌HX081027与摩氏摩根菌属内相关菌株的同源性在98.8%~99.6%,且在系统发育树上与来源于鱼类的M.morganiiJCM1672聚为一支,结合形态及生理生化特点将其确定为摩氏摩根菌(Morganella morganii)。     

棘胸蛙白内障病原鉴定及药敏试验

从患病棘胸蛙(Quasipaa spinosa)中分离到BN1306菌株,经肌肉注射回健康棘胸蛙,复制出棘胸蛙白内障病的基本症状,并显示对棘胸蛙有较强的致病性。通过形态学、生理生化试验、16S rDNA测序等方法鉴定该致病菌为布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)。药敏试验显示该菌对诺氟沙星、链霉素、四环素、吡哌酸高度敏感,对氟哌酸、头孢哌酮、庆大霉素、青霉素、新霉素、林可霉素、先锋霉素和红霉素不敏感。     

黑格尔七彩神仙鱼摩氏摩根菌分离鉴定及耐药性分析

【目的】对患病七彩神仙鱼进行摩氏摩根菌(Morganellamorganii)分离鉴定及药敏试验,为七彩神仙鱼养殖过程中摩氏摩根菌感染的临床诊断和科学用药提供科学依据。【方法】从患病野生黑格尔七彩神仙鱼体表分离病原菌,然后对其进行形态观察、生理生化指标测定及16S rDNA序列分析,并采用纸片扩散法(K-B)进行药敏试验。【结果】从患病野生黑格尔七彩神仙鱼分离获得一株优势菌株(DS2015),该菌为革兰氏阴性杆菌,其生理生化测定结果与摩氏摩根菌的相似度达100%。菌株DS2015的16S rDNA序列1208 bp(GenBank收录号KR866070),由基于16S rDNA序列构建的系统发育进化树可知,菌株DS2015与摩氏摩根菌聚为一簇,Bootstrap检验值为99;Biolog微生物自动鉴定结果也显示,菌株DS2015最具可能性为摩氏摩根菌。药敏试验结果表明,菌株DS2015对庆大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松、氯霉素、诺氟沙星、氧氟沙星和复方新诺明等抗生素高度敏感,对米诺环素中度敏感,对青霉素G、头孢氨苄、头孢拉定、四环素、多西环素、红霉素、克林霉素、万古霉素和呋喃唑酮等抗生素已产生耐药性。【结论】摩氏摩根菌可引起七彩神仙鱼身体发黑、皮肤大量分泌黏液及鳍条溃烂等症状,严重者甚至引起死亡,生产中可选用庆大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松、氯霉素、诺氟沙星、氧氟沙星和复方新诺明等抗生素进行防治。     

乌鳢(Channa argus)源摩氏摩根菌(Morganella morganii)的分离、鉴定及药敏特性

对患病乌鳢(Channa argus)进行病原分离、鉴定及药敏试验,为乌鳢病害防控提供参考。从江西南昌某养殖场发病的乌鳢肝、肾、脾和溃烂肌肉中分离到一株病原菌JX15,对JX15株进行形态学观察、理化特性测定及分子生物学方法鉴定,并对JX15株进行人工感染试验和药敏试验。理化特性测定和16S rRNA与gyrB[DNA促旋酶(gyrase)B亚基]基因序列分析表明,JX15株被鉴定为摩氏摩根菌。病理学和致病性试验显示,病鱼肝、肾、脾及溃烂皮肤肌肉等组织器官具有典型病理变化,人工感染的乌鳢出现与自然发病类似症状,且从发病乌鳢体内分离到与菌株JX15一致的菌株,可以断定菌株JX15是本次乌鳢发病的病原菌,其LD₅₀为3.4×10⁵ cfu·g^-1。JX15株对氟苯尼考、诺氟沙星及头孢噻肟等7种药物高度敏感,对呋喃唑酮、氯霉素、卡那霉素及链霉素4种药物中度敏感;对环丙沙星、苯唑西林及青霉素等11种药物耐药。本研究证明了江西南昌某养殖场的乌鳢溃烂病是由摩氏摩根菌感染所引起的,可选用氟苯尼考、头孢噻肟、新霉素、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星等6种药物进行治疗。     

棘胸蛙柠檬酸杆菌的分子鉴定及防治技术

为确定导致棘胸蛙烂皮病的病原菌及其防治方法,从病死的棘胸蛙头部、腿部和肝部分离得到3株病原菌,分别命名为LJ10201、LJ10202、LJ10203。经形态学观察、生理生化实验、16SrDNA基因序列测定及系统发育学分析鉴定,确认LJ10201、LJ10203菌株为弗氏柠檬酸杆菌,LJ10202菌株为布氏柠檬酸杆菌,分离得到的菌株感染健康棘胸蛙可使棘胸蛙出现烂皮病症状。分离得到的LJ10201菌株对新霉素、头孢拉定(先锋Ⅵ)等9种药物敏感,LJ10202菌株对头孢拉定(先锋Ⅵ)、氯霉素敏感,菌株LJ10203对新霉素、阿奇霉素等8种药物敏感。本研究为棘胸蛙柠檬酸杆菌的分离鉴定及防治提供了理论基础。     

棘胸蛙白内障病原的分离、鉴定及药物敏感性分析

从患有“白内障”的棘胸蛙脑和肝脏中分离并筛选得到一株革兰氏阴性短杆菌PY-SW1506,经人工感染试验证实该菌为棘胸蛙“白内障”病原菌,对该菌进行了生理生化鉴定及16S rRNA基因序列分析,鉴定该病原为脑膜败血伊丽莎白菌。通过药敏纸片扩散法测定了该菌对26种药物的敏感性,结果显示,该菌对恩诺沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、萘啶酸、万古霉素、多西环素、利福平等7种药物高度敏感,对链霉素、头孢噻肟、头孢曲松、头孢西叮等4种药物中度敏感,对氨苄西林、青霉素、头孢唑林等15种药物表现为耐药性。     

杂交鲟鲁氏耶尔森氏菌的分离鉴定及感染的病理损伤

【目的】探究四川省邛崃市某养殖场的杂交鲟Acipenser schrencki♀×A.baeri♂暴发的传染病病因。【方法】从病鱼的肝、脾和肾组织中进行病原菌的分离,结合理化特征和16S rRNA及gyrB基因序列分析对其进行鉴定,同时进行药敏试验及病理损伤观察。【结果】分离到1株G–优势菌(YC160412),通过理化特征分析,16S rRNA及gyr B基因序列分析鉴定分离菌为鲁氏耶尔森氏菌Yersinia ruckeri;药敏试验表明,该病原菌对头孢唑啉、氨苄西林、氟苯尼考等抗生素敏感,对阿莫西林、红霉素等耐药;病理组织学观察发现,鲁氏耶尔森氏菌感染杂交鲟对多组织器官都造成明显的损伤,尤其是肝、脾、肾、肠和鳃,表现为明显的变性、坏死、出血及炎症细胞的浸润,同时在肝、脾和肾组织内有大量病菌分布。【结论】证实了鲁氏耶尔森氏菌是本次疫情的病因,其感染引起杂交鲟多组织器官功能障碍而死亡。     

家蚕黑胸败血病病原菌的分离鉴定

从广西宜州蚕区暴发黑胸败血病的养蚕农户处采集到病蚕样本,分离到1株病原菌,通过形态学观察和回复感染健康5龄家蚕试验及16S rDNA基因序列同源性分析鉴定,结果显示病原菌菌落呈橘黄色,光滑,圆形,边缘整齐,有光泽,湿润有黏性,革兰氏染色呈阳性,该菌形态学符合葡萄球菌属的特征;用菌液穿刺感染健康5龄家蚕10 h后蚕体胸部膨大,痉挛侧倒而死,11 h后胸部变黑呈现黑胸败血病病症;从腹腔接种菌液的小白鼠16 h内全部发病,从发病的家蚕体液和死亡小鼠的心血均能分离到与接种菌株形态一致的细菌,证实该菌为引起家蚕黑胸败血病的病原菌。菌株16S rDNA片段为1 463 bp(Gen Bank ID:1811543),与GenBank数据进行比较,该菌株与松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)同源性为99.9%,鉴定该菌株为松鼠葡萄球菌。     

蛙类歪头、破头与白眼综合征病原分析

为探明湖北、福建等主养区一系列蛙疾病的发病原因,从具有典型歪头、破头与白眼等症状的蛙脑部和内脏器官分离到40株优势菌。经16S rRNA 基因序列比对,发现40株优势菌均与米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)同源。经生理生化鉴定、系统发育分析发现,这40株优势菌存在遗传差异,宿主和区域是影响亲缘关系的重要因素,并判定菌株典型株QW08为米尔伊丽莎白菌。回归感染实验证实QW08为蛙类歪头、破头与白眼病的病原菌。组织病理学观察显示,米尔伊丽莎白菌感染黑斑蛙可引起其全身多脏器与组织损伤,脑、肠道、肝、脾与肾等组织器官损伤极其严重,主要病理变化表现为变性、坏死和炎症反应,致多组织器官功能障碍而引起感染蛙死亡。药敏特性分析显示,分离株QW08仅对氟苯尼考高度敏感,对其余19种抗生素表现出不同程度的耐药。研究结果为蛙类该病防控提供了理论依据。     

鼋摩氏摩根氏菌的鉴定及致病性

本研究旨在寻找引起鼋(Pelochelys bibroni)体表溃烂的致病因子。从北京地区自然患病的鼋体表分离到致病菌株YB0428,采用生理生化鉴定结合16S rRNA基因序列的系统发育学分析确定该菌株的系统发育地位。同时采用琼脂扩散法对抗菌类药物的敏感性进行测定。菌株YB0428与Morganella morganii HX081027的16SrRNA基因序列相似性达94%;结合形态特征与生理生化测定结果,该菌为革兰阴性杆菌,氧化酶阴性;V-P试验反应阴性;柠檬酸盐试验阴性;吲哚阳性;脲酶阳性;鸟氨酸脱羧;不产生赖氨酸和精氨酸双水解酶。在37种抗菌类药物对该菌的抑菌试验中,奈替米星、羧苄西林、哌拉西林等10种药物的抑菌效果较好。确定该菌株在分类上属于摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)。为进一步防治鼋细菌性病害提供了科学依据。     

中华鳖细菌性传染病病原研究

从四川省名山县、攀枝花市养鳖场患鳖红脖子病、穿孔病和出血病的垂死稚、幼鳖的溃烂皮肤组织，肝、脾、肠道组织和血液中分离到３株细菌。用分离的细菌人工感染健康稚鳖，可诱发与自然发病鳖类似的病症。通过对细菌的形态特征、培养特性和生化特性分析，证明：２株致病菌是嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙ－ｄｒｏｐｈｉｌａ），１株致病菌是温和气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓｏｂｒｉａ），３株细菌对兔红细胞均有溶血作用，但溶血能力有差异；对链霉毒等多数抗菌药物敏感，并具有共同的抗原成分     

福建地区不结球白菜黑腐病病原菌的分离与初步鉴定

为鉴定福州地区不结球白菜黑腐病致病菌,以感染黑腐病的不结球白菜植株为材料进行了病原菌分离和鉴定。通过观察所分离病原菌的形态及接种试验发现其形态和发病症状与黑腐病的形态和发病症状相一致。以细菌通用引物16S对该病原菌进行16SrDNA的PCR扩增测序分析,发现该病原菌与野油菜黄单胞菌(Genbank:CP017308.1)16SrDNA序列同源性为99.8%。从接种病原菌植株中重新分离病原菌,其16SrDNA序列与之前接种菌株序列一致。以上结果初步证明分离的病原菌为不结球白菜黑腐病病原菌,且该病原菌为十字花科黑腐病野油菜黄单胞菌野油菜致病种。     

烤烟蛙眼病病原菌的分离鉴定与生物学特性

【目的】明确贵州烤烟蛙眼病病原菌种类及生物学特性,为烤烟蛙眼病的综合防治提供科学依据。【方法】以采集自贵州烟区的烤烟蛙眼病病叶为材料,采用常规组织分离法和离体叶片接种法进行病原菌分离及致病性测定,利用形态学特征和分子生物学方法对病原菌进行种类鉴定,并对典型菌株进行生物学特性测定。【结果】从采集的病叶样本中共分离获得11株菌株,选取具有代表性的3株菌株YC1110、YC1111和YC1112接种到健康烤烟叶片上,接种6 d后出现典型症状,与田间症状一致,证明3株菌株为烤烟蛙眼病病原菌。ITS序列及系统发育分析表明,供试3株菌株与烟草尾孢（Cercospora nicotianae）的遗传关系很近,且菌落及孢子等形态特征亦符合烟草尾孢。生物学特性测定结果显示,病原菌在25℃、pH 7、光照条件为24 h全黑暗、碳氮源分别为果糖和牛肉浸粉、培养基为番茄琼脂培养基（TA2）时产孢量最多;在25℃、pH 7、碳氮源分别为甘露醇和蛋白胨、培养基为胡萝卜琼脂培养基（CA）和烟叶煎汁琼脂培养基（TA1）时生长最快。病原菌菌丝致死温度为54℃水浴10 min。【结论】引起贵州烤烟蛙眼病的病原菌为烟草尾孢。     

一种中华鳖穿孔病病原菌的分离和特性研究

从患有穿孔病的中华鳖的病灶中分离到菌株N₉₉₁₀和N₉₉₁₁。用二菌株分别进行小白鼠和鳖的感染试验,均能使小白鼠死亡及鳖发病,感染鳖出现与自然发病鳖相似的症状,并从人工感染的死亡鳖中再次分离到相同的细菌。经形态特征、培养特性及生理生化反应测定,二菌株均鉴定为摩氏摩根氏菌（Morganella morganii）。药敏试验结果表明：二菌株对氯霉素、菌必治、氟哌酸及丁胺卡那霉素均呈高度敏感。