生防菌株ZA1的GFP基因标记及其功能稳定性测定

为明确生防莫海威芽胞杆菌Bacillus mojavensis菌株ZA1在作物体内定殖与作物和病原物的作用机理,运用电击转化法将绿色荧光蛋白表达载体pGFP78导入菌株ZA1体内,并采用细菌培养法、继代培养法和平板抑制法检测其功能稳定性。结果表明,质粒pGFP78成功导入菌株ZA1,标记后菌株ZA1-gfp经形态学和分子生物学验证均证明菌株ZA1已成功标记,标记菌株ZA1-gfp与菌株ZA1形态一致,在荧光显微镜下呈现明亮的绿色,并且能够提取导入质粒pGFP78,扩展出质粒所携带的启动子78序列。功能稳定性鉴定结果表明,标记菌株ZA1-gfp遗传稳定性达100%;与菌株ZA1的生长速率差异不显著,且不影响菌株的运动性;菌株ZA1对马铃薯枯萎病菌、马铃薯炭疽病菌和马铃薯坏疽病菌的抑制率分别为64.50%、68.35%和66.55%,标记菌株ZA1-gfp对3种病原真菌的抑制率分别为67.46%、76.56%和66.75%,表明外源质粒的导入,不影响菌株的抑菌能力。     

梨果贮藏期病害拮抗细菌的筛选、鉴定和评价

梨轮纹病和炭疽病是梨果贮运过程中常见的两个重要病害,危害严重。本研究采集江苏省淮阴区、淮安区、盱眙县三地梨园病叶、病果、健叶、健果和土壤样本75份,分离纯化后得到365个细菌分离物。采用对峙生长法,测定细菌分离物对梨轮纹病菌和炭疽病菌菌丝生长的皿内抑制作用。采用梨果表面刺伤后接种菌块的方法,测定拮抗细菌对梨果轮纹病和炭疽病的控制作用。结果表明,4株拮抗能力较强的细菌对轮纹病菌菌丝生长的抑制率达73.45%~80.36%,对炭疽病菌菌丝生长的抑制率达72.02%~76.79%。菌株N106-2对黄冠梨和砀山酥梨接种轮纹病菌块后5 d的防治效果达68.58%和56.98%;对黄冠梨接种炭疽病菌块后5 d的防治效果为56.71%。对4株拮抗细菌进行16S r DNA种属鉴定,其中3株为芽胞杆菌属Bacillus,1株为假单胞菌属Pseudomonas。     

绳状青霉P-19不同固体发酵浸提液对马铃薯镰刀菌根腐病病原菌的抑制作用

近年来,由镰刀菌引起的马铃薯根腐病严重影响我国马铃薯产业的发展。本研究通过比较不同发酵产物的抑菌活性,筛选绳状青霉Penicillium funiculosum P-19 菌株最适的固体发酵培养基配方,并通过平板对峙试验测定了其对马铃薯根腐病病原菌尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、接骨木镰刀菌F.sambucinum、茄病镰刀菌F.solani、木贼镰刀菌F.equiseti和锐顶镰刀菌F.acuminatum的抑制作用。结果表明,绳状青霉P-19对尖孢镰刀菌、接骨木镰刀菌、茄病镰刀菌、木贼镰刀菌、锐顶镰刀菌的抑制率分别为38.85%、45.07%、38.92%、28.13%、64.32%。不同培养基发酵后其浸提液对5种镰刀菌的拮抗作用存在较大差异,其中配方为甘草∶玉米粉∶木屑=5∶4∶1时发酵产物对尖孢镰刀菌的抑制率最高,为67.89%,板蓝根∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2时对接骨木镰刀菌的抑制率最高,为67.00%,板蓝根∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2时对茄病镰刀菌的抑制率为64.48%,甘草∶板蓝根∶葡萄皮渣∶玉米粉=2∶2∶10∶5时对木贼镰刀菌的抑制率为50.20%,甘草∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2时对锐顶镰刀菌的抑制率达到78.25%。本研究为马铃薯镰刀菌根腐病的防控以及青霉菌生防制剂的开发和应用奠定了基础。     

橙酮类似物的合成及抑菌活性

以芝麻酚和芳香醛为主要原料,经傅-克酰基化、关环和羟醛缩合反应,设计合成了14个未见文献报道的橙酮类似物,其结构均经1H NMR、MS和IR确证。初步抑菌活性测定结果表明:在100 mg/L下,所有目标化合物对7种供试病原菌均有不同程度的抑制作用,其中化合物 3a、3b、3c和3d 对番茄灰霉病菌Botrytis cirerea的抑制率达到100%, 3g 对小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、玉米弯孢叶斑病菌Curvulavia lunata、棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum vasinfectum、水稻稻瘟病菌Magnaporthe grisea的抑制率均大于80%, 3m 对马铃薯干腐病菌Fusarium solani和玉米弯孢叶斑病菌的抑制率分别为100%和83.8%。     

近缘毛壳菌生防菌株LB-1对几种常见植物病原真菌的拮抗作用及其生长适应性分析

为检测近缘毛壳菌Chaetomium subaffine菌株LB-1的生防效果及其生长适应性,采用平板对峙培养法、含毒培养基法和菌落直径法测定其对6种常见植物病原真菌的拮抗作用,分析其生长的温度、致死温度、光照、pH范围和对干旱胁迫、盐胁迫的抗耐性。结果表明,菌株LB-1对供试的玉米大斑病菌、西瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、玉米小斑病菌、马铃薯早疫病菌和马铃薯晚疫病菌均具有拮抗作用,PDA平板对峙培养抑制率分别为63.38%、60.59%、60.05%、52.53%、50.46%和44.10%。菌株LB-1的培养液对6种供试病原菌菌落扩展也有显著抑制作用,而且供试病原菌在含菌株LB-1培养液的PDA平板上形成的菌落瘠薄稀疏,菌丝层溶解明显,其中对玉米大斑病菌抑制作用最强,抑制率为30.45%,对马铃薯晚疫病菌抑制作用最弱,抑制率为12.33%。菌株LB-1生长的温度范围为4~37℃,最适温度为25℃,致死温度为60℃;pH范围为5~13,pH 7时生长最好;持续光照对菌株LB-1生长具有显著抑制作用。当PDA平板中PEG 6000含量低于25%,NaCl含量低于1 mol/L时,菌株LB-1均能够较好地生长。表明菌株LB-1是1株具有广谱抑菌特性的生防近缘毛壳菌,对光照、温度、pH有很好的适应性,对干旱及盐胁迫有极强的抗耐性。     

一株粪生毛壳菌的分离鉴定及其对辣椒枯萎病的防治效果

本文采用平板对峙法和抑菌圈法从76株粪生真菌中筛选出1株辣椒枯萎病生防菌株LJ-S2L1,并利用菌落直径法、纸片扩散法、室内毒力测定和盆栽试验评价了其防病效果。结果表明,菌株LJ-S2L1对辣椒枯萎病菌抑菌率达71.67%,可使辣椒枯萎病菌菌丝发生隘缩或断裂,抑菌圈直径达32 mm;菌株LJ-S2L1发酵液和无菌发酵滤液均对辣椒枯萎病菌菌丝生长有抑制作用,抑制率分别达61.57%和56.48%。毒力测定结果表明,菌株LJ-S2L1发酵液对辣椒枯萎病菌的抑制率在1000μL/m L时达到72.10%,抑制中浓度为300.63μL/m L;盆栽试验防治效果达到71.8%。根据形态学特征结合其分子系统发育树分析,将菌株LJ-S2L1鉴定为球毛壳菌Chaetomium globosum。     

噻呋酰胺与嘧菌酯混配对马铃薯黑痣病菌增效作用及其田间防效

为明确噻呋酰胺与嘧菌酯混配对马铃薯黑痣病菌Rhizoctonia solani的增效作用及对马铃薯黑痣病的田间防效,采用菌丝生长速率法和田间药效试验测定二者混配组合对其的联合毒力,分别用Wadley法和Abbott法评价混配组合的增效作用,并比较拌种、沟施及苗期茎基部喷淋3种施药方式对黑痣病的田间防效。结果表明,噻呋酰胺与嘧菌酯以质量比3∶1、2∶1、1∶1和1∶2进行混配时抑制马铃薯黑痣病菌菌丝生长的增效系数分别为1.7、2.7、2.5和1.9,其中2∶1和1∶1的混配组合增效作用较为明显。240 g/L噻呋酰胺悬浮剂与250 g/L嘧菌酯悬浮剂1∶1桶混以240 g(a.i.)/hm~2沟施对马铃薯黑痣病的防效优于拌种和苗期茎基部喷淋的防效,沟施方式下对植株黑痣病的防效为65.3%,对薯块黑痣病的防效为71.6%,增效系数为1.1,表现增效作用。表明噻呋酰胺与嘧菌酯有效成分质量比1∶1的混配组合以240 g(a.i.)/hm~2为推荐剂量沟施可有效防治马铃薯黑痣病。     

香蕉枯萎病拮抗细菌的分离筛选与鉴定

从采集的香蕉根际土壤中经分离、纯化获得细菌菌株74个,采用对峙培养法,获得对香蕉枯萎病菌4号小种具有强抑制作用的菌株S-1,相对抑制率达76%。抑菌谱测定表明,菌株S-1对尖孢镰刀菌古巴专化型1号小种、番茄枯萎病菌、玉米弯孢叶斑病菌、胶孢炭疽病菌、棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌等病原菌具有抑制作用。经Biolog系统鉴定及16S rDNA序列同源性分析,菌株S-1为枯草芽孢杆菌。该菌株理想的培养条件为：PYTG或PDA培养基,26-30℃,pH值7.0-8.0,振荡培养40-48h。     

枯草芽胞杆菌发酵液对苹果树腐烂病的防治效果

为明确来自苹果树上的1株生防菌LF17对腐烂病菌的抑制作用及其发酵液对腐烂病的防治效果,采用形态学结合16S rDNA和gyrA基因序列分析对菌株LF17进行了鉴定,并通过滤纸法测定了发酵液对腐烂病菌的抑制率,利用涂抹发酵液的方法测定了发酵液对腐烂病的防效。结果表明,菌株LF17发酵液对腐烂病菌的抑菌率为93.80%,与甲基硫菌灵(94.20%)抑菌率相当,显著高于嘧菌酯(42.60%)、辛菌胺(52.80%)和苯醚甲环唑(81.30%);离体枝条防治结果表明,发酵液水剂和膏剂对腐烂病的防效为78.59%～80.40%,与甲基硫菌灵(76.93%)相比差异不显著,与嘧菌酯(44.15%)、辛菌胺(68.25%)、苯醚甲环唑(74.45%)相比差异显著;田间试验表明,涂有发酵液的伤口愈合面积为9.37～9.79 cm~2,病疤复发率为3.82%～4.56%,与其他4种药剂相比差异显著。研究表明菌株LF17发酵液对腐烂病菌有明显抑制作用,且可促进伤口的愈合并显著降低腐烂病的复发。     

拮抗马铃薯晚疫病菌的高寒草地牧草内生细菌的鉴定及其生物功能测定

为获得对马铃薯晚疫病菌Phytophthora infestans具有拮抗效果的内生细菌,采用平板对峙法对21株分离自东祁连山高寒草地牧草的内生细菌进行抑菌能力测定,并结合形态学特征和16S r DNA基因序列同源性分析对拮抗菌株进行鉴定。结果表明,分离的21株内生细菌对马铃薯晚疫菌均有一定的抑制作用,其中262AY11、262AY6和264AY2抑菌效果最好,抑菌率分别为78.41%、78.03%和75.38%,根据16S r DNA基因序列分析将其分别鉴定为韦氏芽胞杆菌Bacillus weihenstephanensis、解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens和枯草芽胞杆菌B.subtilis,在Gen Bank中的登陆号分别为KC414703、KC441759和HQ202817。262AY11和262AY6具有固氮能力;262AY6具有分泌IAA能力,在不含和含色氨酸的金氏培养基中产IAA的量分别为9.94 mg/L和14.79mg/L,且对马铃薯坏疽病菌Phoma foveata、马铃薯枯萎病菌Fusarium avenaceum和马铃薯炭疽病菌Colletotrichum coccodes的抑菌率分别为70.25%、62.38%和81.75%;264AY2对3种病原菌的抑菌率分别为67.09%、50.75%和75.99%。表明芽胞杆菌262AY11、262AY6和264AY2能有效抑制马铃薯晚疫病菌的生长,具有固氮和产IAA的生物学功能,且对另外3种马铃薯病原真菌也具有一定的生防潜力,可作为生防菌进行开发和利用。     

拮抗内生细菌Bacillus mojavensisZA1在马铃薯根内及根际的定殖动态及其对土壤微生物的影响

利用GFP标记和平板分离法研究了拮抗内生细菌Bacillus mojavensisZA1在马铃薯根内及根际的定殖动态及其对土著微生物的影响。结果表明,标记菌株ZA1-gfp在土壤中定殖数量为3.7×10⁴~7.3×10⁴cfu/g;马铃薯根际为3.0×10³~1.5×10⁵cfu/g,根内为49~630cfu/g;马铃薯的根部横切面、根毛和根表皮等部位均观察到发绿色荧光的菌株ZA1-gfp菌体或聚集菌落。利用灌根法施入生防菌后,土壤中细菌、放射菌数量显著增加(P<0.05),土壤真菌数量在中期下降;土壤中细菌、真菌和放线菌的数量分别在相对稳定范围内(数据之间差异不显著)消长。该结果说明菌株ZA1-gfp能够在马铃薯根内及根际定殖且不影响土壤中土著微生物的群落稳定性。     

生防菌XC-1的筛选、鉴定及其对马铃薯黑痣病的防效研究

 从马铃薯根际土壤中分离筛选得到对立枯丝核菌有较强拮抗作用的菌株XC-1,对其进行鉴定及生防特性分析,并评价其对马铃薯黑痣病的生防效果。形态学、16S rDNA和gyrB基因序列分析以及生理生化检测结果表明,XC-1菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。XC-1菌株具有产纤维素酶、蛋白酶及嗜铁素和HCN能力。同时,具有产生脂肽类活性物质的能力。其发酵液能导致立枯丝核菌菌丝断裂、折叠、膨大等,进而抑制其生长。田间试验结果表明,XC-1在马铃薯苗期、花期以及收获期均有防效,在收获期生防效果达到54.51%。同时,经菌株XC-1菌悬液接种处理后的马铃薯产量与对照组相比增加了22.02%。XC-1是马铃薯黑痣病生防制剂的潜力菌株,具有良好的开发和应用价值。     

一株拮抗4种马铃薯病原真菌的拟康宁木霉的分离鉴定

本研究从黑龙江省土壤中分离获得一株木霉, 运用生物学特征和ITS序列分析相结合的方法将其鉴定为拟康宁木霉Trichoderma koningiopsis?薯块活体抑菌测定表明, 该木霉对接骨木镰孢Fusarium sambucinum?马铃薯早疫病菌Alternaria solani?立枯丝核菌Rhizoctonia solani (AG3和AG5)等病原真菌引起的马铃薯病害具有抑制作用?对峙培养试验结果显示, 该木霉对上述病原菌的生长具有拮抗作用, 平均抑制率均超过50%, 且该木霉生长速度快于上述病原真菌, 以竞争生长方式抑制病原菌菌丝生长和菌核形成?采用扫描电子显微镜观察发现, 该木霉可通过缠绕或并行生长等方式寄生在上述病原真菌菌丝上?以上结果表明, 从土壤中分离获得的拟康宁木霉具备良好的生防潜力, 可为马铃薯种植中多种真菌病害的统防统治提供良好的生防菌株?     

马铃薯块茎蛾幼虫致病黏质沙雷氏菌的分离鉴定及杀虫活性

从马铃薯田自然罹病马铃薯块茎蛾幼虫上，分离到1株对马铃薯块茎蛾幼虫具有较强致病作用的菌株ML-1，通过形态及16S rRNA序列测定分析，确定该菌株ML-1为黏质沙雷氏菌Serratia marcescens。采用饲喂法分别测定了该菌株ML-1菌悬液、发酵液及发酵上清液对马铃薯块茎蛾初孵3日龄幼虫的毒力。结果表明，用ML-1菌悬液、发酵液及发酵上清液饲喂后第7 d时，马铃薯块茎蛾3日龄幼虫的累积校正死亡率分别为63.16%、80.70%和49.12%，在3.0×10⁹ cfu/mL浓度下的LT₅₀分别为4.71、3.04和6.47 d，在发酵液处理后第3、5和7 d的LC₅₀分别为9.784×10¹⁰、1.855×10⁸和5.434×10⁵ cfu/mL。综上所述，黏质沙雷氏菌ML-1菌株对马铃薯块茎蛾幼虫有较强的毒力，在马铃薯块茎蛾绿色防控中具有一定的开发潜能。     

马铃薯枯萎病生防芽胞杆菌筛选及生防效果研究

马铃薯枯萎病是马铃薯主要土传真菌病害之一，已成为限制我国马铃薯产业健康发展的重要因素之一。菌株ZF128是本实验室从马铃薯根际土壤分离筛选得到的一株对马铃薯枯萎病菌具有显著抑制效果的生防细菌。经生理生化、BIOLOG GENIII和系统发育树分析，鉴定菌株ZF128为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis。抑菌谱测定结果显示，ZF128对5种病原真菌和5种病原细菌都具有显著拮抗效果。光学显微观察发现，菌株ZF128处理的病原菌菌丝生长受到抑制并出现膨胀变粗现象。发酵试验表明，菌株ZF128在甘露醇培养基中发酵上清液对马铃薯枯萎病菌的抑制效果最好。盆栽试验结果证明，接种菌株ZF128后马铃薯发病明显减轻，防效为82.46%。此外，定殖和促生试验表明，菌株ZF128能在马铃薯根际和根部有效定殖30d以上，处理组马铃薯株高、根长、地上部和地下部鲜重及叶绿素含量等指标均显著高于对照组。综上，菌株ZF128生防性状优良，是一株具有潜在应用价值的芽胞杆菌。     

马铃薯疮痂病菌致病相关基因的克隆及表达

 A pathogenic-related gene nec1 was cloned in Streptomyces scabies CPS-1, potato scab strain. Analysis results showed that the length of open reading frame(ORF) for nec1 gene was 666 bp, and the GC content was 54.2%. Sequence alignment indicated that a 650 bp up-stream sequence shared 91% similarity with IS 256 family transposase nucleotide sequences by BLASTn searches against GenBank. The segments obtained by PCR amplification were digested by enzymes SphⅠand SacⅠ, and linked to the expression vector pIJ702. The recombinants were transformed into nonpathogenicity strain Streptomyces lividans 66 TK24. Bioas-say results suggested that the transformants possessed the same symptoms as pathogenic strain on potato tuber slices and radish seedlings, which implied that nec1 gene was associated with the pathogenicity of S. scabies CPS-1.     

马铃薯内生细菌的分离及环腐病拮抗菌的筛选鉴定

 本研究从大同、太原和内蒙古等地采集马铃薯块茎,分离到240株内生细菌,通过离体抑菌作用测定,共得到55株对环腐病菌有拮抗作用的菌株,占菌株总数的22.9%,抑菌圈半径最大的可达13 mm。按抑菌圈半径大小将拮抗菌分为强、中、弱三类。从中筛选出9个对环腐病等病菌具有较强拮抗作用的内生菌株进行了细菌学鉴定,结果表明:118为荧光假单胞生物型V (Pseudomonas fluorescens biovar V);110为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus);085为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus);069为草生欧文氏菌(Erwinia herbicola);043为草莓黄单胞菌(Xanthomonas fragariae);A-10'、T3为芽孢杆菌属(Bacillus);H1-6为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens);116为短小杆菌属(Curtobacterium)。     

70%噻虫嗪种子处理可分散粉剂和10%吡虫啉可湿性粉剂拌种对马铃薯甲虫的防效

利用药剂拌种处理马铃薯种薯后播种的方法,研究比较了2种新烟碱类杀虫剂对马铃薯甲虫的活性和防治效果。结果表明,按药剂有效成分18 g/100 kg种薯拌种,70%噻虫嗪种子处理可分散粉剂拌种出苗后60 d对马铃薯甲虫幼虫的生物活性和防效较高,卵块孵化率较低,死亡率在61.1%以上,防效达57.3%,孵化率为36%,这有利于降低马铃薯甲虫种群数量,减轻为害。而10%吡虫啉可湿性粉剂拌种出苗后60d对马铃薯甲虫幼虫生物活性和防效较低,卵块孵化率较高,死亡率在12.5%以下,防效为37.1%,孵化率为64.6%,对马铃薯甲虫的控制效果较差。     

拮抗链霉菌26B的筛选及其在不同含水量土壤中对白菜软腐病的防病效果

为挖掘防治白菜软腐病的生防菌,本研究采用牛津杯法从38株白菜根际放线菌中筛选到一株拮抗放线菌26B,通过形态学观察和16S rRNA基因序列分析将菌株26B初步鉴定为链霉菌。该菌除菌发酵滤液对供试的白菜软腐病菌Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliensis BC1及3种马铃薯黑胫病菌均表现较高的抑菌活性,其中对白菜软腐病菌抑菌直径达到23.97 mm。萌发试验表明,白菜种子经26B除菌发酵滤液浸种后发芽势、发芽指数、根长及鲜重显著增加。采用浸根法测定菌株26B除菌发酵滤液对软腐病菌荧光标记菌株BC1-gfp在白菜根部定殖量的影响,浸根处理后48 h,白菜根上BC1-gfp的数量达到2.3×10⁹ CFU/g;未从26B除菌发酵滤液与BC1-gfp菌悬液混和处理（体积比10%）的白菜根上检测到病原菌。盆栽防病试验结果表明,在含水量为14%和20%的土壤中,菌株26B除菌发酵滤液对白菜软腐病的防效分别达96.0%和89.8%。上述结果表明,链霉菌26B是一株具有潜在开发应用价值的生防菌株,将链霉菌26B应用与土壤水分管理相结合可进一步提高其防病效果。