巴西橡胶树的次生体细胞胚胎发生—— 一种新的长期性体细胞胚胎发生诱导方法

在橡胶树中，以未成熟种子的内珠被为外植体通过其胚性愈伤组织的继代增殖可以持续不断地诱导体细胞胚胎，该方法称为持久体细胞胚胎发生(Maintained Somatic Embryogenesis，MSE)。然而，直接利用内珠被组织诱导易碎型胚性愈伤组织系不但频率很低，而且迄今仅无性系PB260和RRIM703能够藉此途径实现体细胞胚胎的长期诱导。本研究以体细胞胚胎为外植体成功诱导和建立可增殖胚性愈伤组织系。组织学分析显示，体胚外植体切口边缘表皮及周维管细胞脱分化导致易碎型胚性愈伤组织的产生。所获愈伤组织经继代增殖和筛选最终得以建立胚性愈伤组织系。该新方法被称为间接次生体细胞胚胎发生(Indirect Secondary Somatic Embryogenesis，SSE)。我们还就体胚及内珠被2种外植体诱导胚性愈伤系的潜力进行了深入比较。结果表明，采用体胚外植体诱导胚性愈伤组织系其频率明显高于内珠被外植体。除了PB260和RRIM703之外，我们通过SSE途径还成功建立了无性系PB217的胚性愈伤组织系，而该无性系之前一直难以用MSE法获得其胚性愈伤系。此外，采用SSE法建立胚性愈伤系所需继代培养的次数也大为减少。对于不少仅实现初生体细胞胚胎发生的无性系而言，该方法无疑为其长期性体胚发生的诱导开辟了一条新的途径。     

铁兰体细胞胚的诱导及植株再生

以铁兰无菌苗为外植体,研究不同激素配比对铁兰胚性愈伤组织诱导及体细胞胚形成的影响,并对体细胞胚的发生过程进行形态学观察.结果表明:2,4-D对铁兰胚性愈伤组织的诱导具有重要作用,诱导铁兰胚性愈伤组织的最适2,4-D浓度为2.0 mg/L;胚性愈伤组织在含ABA的培养基上可分化形成体细胞胚.形态及解剖学观察表明,愈伤组织既可以产生于外植体的外层细胞,又可产生于外植体的深层细胞.体细胞胚的形态发生经历了与合子胚形态发生相似的阶段,即经过球形胚、子叶形胚等.胚经过萌发、芽的伸长和生根后形成再生植株.     

橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织的诱导及其植株再生

以高产优质橡胶品种热研88-13的幼嫩种子内珠被为外植体材料,对愈伤组织诱导培养基和继代培养基中的影响因素如植物生长调节剂的种类和浓度、钙离子浓度等进行了研究。经过连续6个月的继代选择培养,逐渐诱导出易碎的胚性愈伤组织,适宜的易碎胚性愈伤组织诱导培养基为:MH基本成分,添加0.5 mg/L KT,2.0 mg/L 2,4-D,11.0 mmol/L CaCl2,80.0 g/L蔗糖和2.0 g/L Phytagel。组织学切片证明长期继代培养的易碎胚性愈伤组织维持了胚性的状态。取继代培养2 a多的易碎胚性愈伤组织诱导体细胞胚的形成,得到了16 000多个体细胞胚。将这些胚进行进一步的转移培养,得到了115株再生植株。     

细胞分裂素对蝴蝶兰胚性愈伤组织诱导的影响

分别以6-Benzylaminopurine(6-BA)和2,4-Dichloro phenoxyacetic acid(2,4-D)诱导蝴蝶兰外植体.6-BA从嫩茎切块诱导出胚性愈伤组织,细胞富含淀粉粒,而2,4-D得到的愈伤组织不能分化.6-BA易于从嫩叶切片诱导胚性愈伤组织,进行体细胞胚发生过程的显微观察和代谢分析.6-BA诱导期间,DNA含量上升伴随胚性愈伤组织生长,水溶性蛋白变化稍延缓于RNA含量变化.培养第11天新出现12.13,13.08,66.30,97.25,104.31 ku蛋白质,可能与胚性细胞出现有关,第25天新出现40.87 ku蛋白质,与体细胞胚形成有关.     

甘蔗胚性愈伤组织发生与发育的组织细胞学观察

运用石蜡切片染色和显微技术相结合的方法,对FN15和ROC22两个不同基因型甘蔗品种,在心叶诱导愈伤组织和愈伤组织继代过程的不同阶段,对愈伤组织胚性细胞、体细胞胚和芽原体的发生与发育进行了研究。结果表明,愈伤组织来源于切口部位、韧皮部、维管束鞘或外皮层具有活力潜能的薄壁细胞,此种愈伤组织多数为胚性细胞。基因型FN15可从心叶直接诱导出体细胞胚,而基因型ROC22则需继代培养后才发生体细胞胚。从愈伤组织表型分析,浅黄色愈伤组织多数为胚性细胞;金黄色和乳白色愈伤组织多数是已分化的各种类型的体胚;褐色愈伤组织,只有极少量细胞具有分裂能力,最终也能分化出小芽;透明状愈伤组织一般无细胞质,也不具分裂能力。因此应选择浅黄色的愈伤组织作为转基因准备受体。     

杂交水稻幼穗培养体胚发生的效果观察

利用籼粳型和籼籼型以及光温敏核不育型共5个组合杂交水稻的幼穗进行离体培养探讨杂交水稻的愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生,除成功诱导出愈伤组织与体细胞胚外,在所试验材料研究中还显示出以下趋势:(1)籼粳型幼穗愈伤组织诱导率高于籼籼型,两者又都高于光温敏核不育型;(2)体细胞胚胎发生与愈伤组织的胚细胞生活力为关。材料之间胚性细胞生活力与体胚发生率呈籼梗型≥光温敏核不育型>籼籼型的趋势;(3)建立了体细胞无性系和获得大量体胚的培养程序,为进行两系杂交稻的有关基因导入等遗传操作提供了较理想的研究材料。此外,光温敏核不育系杂交后幼穗培养得到体胚尚属国内外首次报道。     

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)毒素对小麦幼胚愈伤组织诱导和分化的影响

为了给普通小麦抗赤霉细胞工程育种中抗毒素细胞系选择技术体系的建立和方法的选择提供理论依据，研究了离体培养条件下禾谷镰刀菌毒素胁迫对小麦幼胚愈伤组织诱导和分化的影响。结果表明．禾谷镰刀茵毒素对小麦幼胚胚性愈伤组织的诱导具有低浓度促进和高浓度抑制、毒害作用，这种毒害作用降低了胚性愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织质量，显著影响胚性愈伤组织再生频率。同时禾谷镰刀茵毒素胁迫降低了幼胚愈伤组织产量，并随胁迫浓度的升高，愈伤组织产量迅速下降。禾谷镰刀菌毒素对小麦幼胚培养特性的影响，表现出基因型间的差异，对感病基因型的毒害作用远大于抗病品种。     

内源激素IAA、ABA对大豆萌发子叶胚性愈伤组织诱导及其分化的调控

内源激素ＡＢＡ、ＩＡＡ含量的高低影响到不同大豆品种愈伤组织诱导和分化的难易，内源激素ＩＡＡ含量高，愈伤组织容易诱导；内源激素ＡＢＡ含量高，愈伤组织却容易分化。在分化培养过程中取不同时期的胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织，测定其ＡＢＡ、ＩＡＡ含量，发现胚性愈伤组织的ＡＢＡ和ＩＡＡ高于非胚性愈伤组织，并且均在培养的第６天达到最大值。然而，非胚性愈伤组织的ＡＢＡ／ＩＡＡ的比值较胚性愈伤组织晚２天达到最大值。     

内源激素IAA,ABA对大豆萌发子叶胚性愈伤组织诱导及其分化的调控

内源激素ＡＢＡ，ＩＡＡ含量的高低影响不同大豆品种愈伤组织诱导和分化的难易，内源激素ＩＡＡ含量高，愈伤组织容易诱导，内源激素ＡＢＡ含量高，愈伤组织却容易分化。在分化培养过程中取不同时期的胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织，测定其ＡＢＡ，ＩＡＡ含量，发现胚性愈伤组织的ＡＢＡ和ＩＡＡ高于非胚性愈伤组织，并且均在培养的诲６天达到最大值。     

不同菜用大豆品种的胚胎发生与再生

以8个菜用大豆品种的未成熟子叶为外植体,在MS(附加高浓度2,4-D)培养基诱导愈伤组织形成、体细胞胚胎发生与再生植株.结果表明:八个菜用大豆品种的未成熟子叶均可诱导产生愈伤组织与体细胞胚胎发生,出愈率为14.71%～100%.体细胞胚胎发生率变化在0～36.76%之间,绿子叶菜用大豆没有形成体细胞胚.体细胞胚可正常萌发产生小植株,移栽成活结实.菜用大豆的出愈率和体细胞胚胎发生率与基因型有关.     

两个栽培大豆品种的体细胞胚胎发生和植株再生研究

通过优化培养条件,即提高植物生长激素浓度和蔗糖浓度,发展了一种再生频率较高的大豆植株再生的方法。从栽培大豆品种幼胚中诱导形成的体细胞胚性愈伤组织和胚状体可以进一步分化出芽和根,发育成完整植株,中黄４号植株再生频率最高可达３９％,早熟１８号仅得到了胚性愈伤组织。     

新疆彩色棉体细胞胚状体的发生及植株再生

以彩色棉栽培品种“新彩 3号”、“新彩 4号”等无菌苗下胚轴为诱导材料进行了组织培养 ,研究了不同基因型及诱导培养基中添加多种激素 2 ,4-D、NAA、IAA、ZT与 KT组合时 ,对愈伤组织诱导及体细胞胚胎发生的影响。实验结果表明在培养基中 2 ,4- D0 .0 5～ 0 .1 mg·L-1,KT0 .1～ 0 .2 mg· L-1时诱导效果最佳 ,产生了颗粒状、分散性好、淡黄色的胚性愈伤 ,胚性愈伤经分化培养基继代 2～ 3次后获得萌发胚 ,萌发胚在生根培养基培养数日后 ,形成了根、子叶、真叶完整的再生植株。并且不同基因型品种愈伤组织和胚胎发生能力表现有所差异。这是国内首次报道利用体细胞胚胎发生获得彩色棉再生植株。     

香蕉胚性细胞悬浮培养方法的改进

针对香蕉胚性悬浮细胞培养过程中存在的胚性愈伤组织的诱导率低、周期过长、胚性易丢失等问题, 以“苹果蕉”及“威廉斯”香蕉的未成熟雄花为试验材料, 对香蕉胚性愈伤组织的诱导、 悬浮培养的理化条件进行改进。 结果表明： （1）光照条件较暗培养更有利于诱导理想的香蕉胚性愈伤组织; （2）M1培养基中加入酪蛋白和脯氨酸有利于胚性愈伤组织的诱导; （3）用微孔板代替三角瓶悬浮培养, 有利于悬浮细胞分裂增殖, 而且可减少污染的可能。     

橡胶树体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶基因（HbSERK1）的克隆及表达分析

从橡胶树体细胞胚中克隆了一个与体细胞胚胎发生相关的类受体蛋白激酶基因,命名为HbSERK1。HbSERK1长2 159 bp,含有一个1 482 bp的阅读框,编码493个氨基酸。HbSERK1序列与毛果杨、葡萄、胡萝卜、马铃薯、拟南芥和燕麦的体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶同源性分别为91%、90%、88%、88%、87%、86%。生物信息学分析表明,HbSERK1含有一个高度保守的蛋白激酶家族结构域,同时含有ATP结合区、蛋白激酶活化位点和Ser/Thr活性位点。RT-PCR半定量分析表明,HbSERK1在叶、胶乳、雄花、生长在愈伤诱导培养基上30 d和50 d的愈伤组织及生长在胚状体诱导培养基上12 d的胚性愈伤组织中均未表达,而生长在胚状体诱导培养基上21 d和40 d的胚性愈伤组织及成熟体细胞胚中表达。橡胶树HbSERK1基因主要在体细胞胚发生的早期表达,表明其可能参与橡胶树的体细胞胚早期发生过程。     

水稻成熟胚盾片诱导愈伤组织再生体系的建立

采用水稻成熟胚盾片诱导愈伤组织作为分化再生的外植体，通过优化激素组合和调节培养基渗透压，建立了适合水稻遗传转化的高效再生体系，将水稻成熟胚诱导愈伤组织分化再生的过程划分为3个不同时期，即成熟胚盾片愈伤组织诱导，胚性细胞诱导保持，胚性愈伤组织分化再生，以CultureI(LS 2,4-D2.0mg/L)诱导成熟胚盾片愈伤组织，愈伤组织剥离后接种于Culture II-3(LS 2,4-D 2.5mg/L 山梨醇3g/L)上诱导胚性愈伤组织，继代后接种于Culture Ⅲ-2(MS NAA 0.5mg/L 6-BA 1.0mg/L Kinetin 2.0mg/L 山梨醇8g／L）上分化成苗，培养结果表明，该再生体系所获得的胚性愈伤组织分化再生率均在60％－80％之间，利用本研究建立的高效再生体系建立水稻外源基因遗传转化系统，使转化过程中所得转化愈伤组织高效再生成苗，从而顺利获得转化植株，可以提高水稻外源基因转化的效率，为水稻品种的定向遗传改良提供优良的遗传转化技术体系。     

棉花不同基因型胚珠离体条件下愈伤组织形成的研究

棉花体细胞愈伤组织的诱导和植株再生,对棉花遗传育种的研究具有重要意义。但是,与其它植物相比,棉花再生植株的频率很低,且在离体培养条件下难以获得有活力的愈伤组织,并使其继续生长。本试验的     

适合全周期间作的橡胶树品种热垦628花药再生体系研究

在橡胶树体胚发生再生体系研究中，如何快速获得胚性愈伤组织是能否成功建立再生体系的关键。本研究基于课题组前期的研究基础，以橡胶树花药为外植体，通过正交试验设计方案研究了毒莠定、KT、6-BA、IAA四种激素的不同浓度组合对橡胶树花药胚性愈伤组织诱导的影响，结果表明：橡胶树花药愈伤组织诱导的最优组合培养基为MS基础培养基，硫胺素0.4 mg/L、天冬酰胺300 mg/L、水解酪蛋白100 mg/L、脯氨酸100 mg/L、精氨酸100 mg/L、谷氨酰胺100 mg/L、L-半胱氨酸-盐酸盐50 mg/L、蔗糖70 g/L、椰子水50 mL/L、植物凝胶2.2 g/L，并添加毒莠定浓度20 mg/L、KT浓度2 mg/L、6-BA浓度1 mg/L、IAA浓度0 mg/L，愈伤组织诱导率达73.3%～100%。所有处理在诱导愈伤组织25～28 d左右，愈伤组织达到快速增殖时期，对胚性愈伤组织的诱导起主要作用的是毒莠定浓度，其浓度在20～30 mg/L之间时，对胚性愈伤组织的诱导有促进作用。低浓度的毒莠定虽然也能诱导愈伤组织产生，但是这些愈伤组织几乎为无胚胎发生能力的非胚性愈伤组织。同时用获得...     

甜菜基因型的筛选及胚性细胞系建立的研究

通过以甜菜未成熟胚为外植体诱导愈伤组织，再将产生的愈伤组织转移至分化培养基（ＭＳＢ培养基附加１．０ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ、３％蔗糖、８％琼脂）进行分化力测试实脸，筛选出两个再生能力强的基因型─８９３０、ＧＤ＿２．通过挑选淡黄色或灰白色、呈颗粒状的愈伤组织继代培养，经调节培养基的ＩＡＡ和ＮＡＡ的浓度，得到再生能力强的胚性愈伤组织，建立了胚性细胞无性系。     

小麦成熟胚诱导胚性愈伤组织的影响因素

为加快小麦成熟胚在转基因研究中的利用,以陕麦159成熟胚为外植体,通过胚性愈伤组织诱导,建立了一套有效的小麦愈伤组织诱导体系。研究表明,不同消毒处理、2,4-D浓度和接种方法对胚性愈伤出愈率的影响有极显著差异,不同浸种时间和培养基类型对胚性愈伤组织出愈率的影响无显著差异。采用次氯酸钠初次消毒20min,升汞二次消毒5min,消毒彻底,对种子损害较小;浸种时间18～20h易于成熟胚的剥取,且诱导的愈伤组织质量较好;MS培养基较1/2MS培养基诱导愈伤组织效果好,MS培养基2,4-D浓度为4mg.L-1时（30g蔗糖＋7g琼脂）胚性愈伤组织率最高,愈伤组织质量较好;完整胚诱导胚性愈伤组织率最高达84.17%,碎胚诱导胚性愈伤组织率最高达94.17%。     

裸燕麦胚性愈伤组织诱导及植株再生能力的研究

裸燕麦成熟胚在ＩＮ６培养基上诱导并继代所形成的是白色、瘤状、外软内硬、易分化植株的非松脆型愈伤组织．当在ＩＭ１—ＩＭ４培养基上进行循环式调控培养时，经７—８个月，初始愈伤组织状态转变为浅黄色、小颗粒状、生活力强的松脆型胚性愈伤组织，有效地减缓了愈伤组织经长期继代过程中生活力的衰退，并能稳定地维持胚性愈伤组织达９５％以上．对植株再生能力测定表明，调控的胚性愈伤组织具有较强的分化潜力，维持时间可达２年以上．