牦牛生长激素基因的测序和多态性研究

采用PCR产物直接测序法获得牦牛生产激素基因（GH基因）891bp序列。通过GenBank中的Blastn软件进行序列比较分析表明，牦牛GH基因与普通牛GH基因的同源性为98%，与水牛，山羊，绵羊同源性分别为96%，94%，93%：NJ法构建的分子系统树显示，牦牛与普通牛亲缘关系最近，其次为水牛，而与山羊，绵羊的亲缘关系较远，此外，采用PCR-RFLP方法研究了30头牦牛GH基因891bpDNA片段，未发现MspⅠ/HpaⅡ酶切位点多态性，表明牦牛GH基因的多态性比较贫乏。     

欧拉型藏绵羊GHRHR基因部分片段的克隆及多态性研究

对欧拉型藏绵羊生长激素释放激素受体(GHRHR)基因部分片段进行PCR扩增和克隆测序(GenBank Accession No:EU289218),利用BioEdit7.0.9.0、DnaSP 4.10.9和MEGA4.0等生物信息学软件对该部分序列与GenBank中普通牛、瘤牛、水牛相应序列进行比对分析,并对58只欧拉型藏绵羊该基因片段进行SmaI-RFLP研究。结果表明:欧拉型藏绵羊与普通牛、瘤牛、水牛3个物种基因序列间同源性大小依次为92.5%、92.0%、91.5%;4个物种间共发现41处序列间碱基差异(9.65/100 bp),其中藏绵羊与普通牛、瘤牛、水牛3个牛亚科物种均存在差异碱基29处。碱基变异类型主要表现为碱基转换和颠换,少数为碱基插入和缺失。推导的部分氨基酸序列间同源性大小依次为88.8%、88.8%、94.4%。58只欧拉型藏绵羊该基因片段SmaI-RFLP分析均为单态,表现为AA基因型。     

内蒙古阿尔巴斯绒山羊与蒙古绵羊BMP2部分基因片段的克隆及分析

从阿尔巴斯绒山羊及蒙古绵羊血中提取基因组DNA,根据已报道的BMP2基因的保守序列设计上下游引物,扩增山羊及蒙古绵羊的BMP2基因部分序列,将此片段克隆到pMD18-T载体中,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,进行序列测定,并将两者序列进行比对.结果山羊该核苷酸片段与绵羊的同源性达99%,与人的同源性87%,与小鼠的同源性85%,与牛的同源性98%.说明该基因在不同物种间具有较高的保守性,尤其是山羊与绵羊之间具有更高的保守性.     

西农萨能羊凝乳酶原前体cDNA的克隆与序列分析

参照GenBank登录的绵羊凝乳酶原前体cDNA序列设计引物,以新生5d的西农萨能羊皱胃组织总RNA为模版,通过RT-PCR方法获得凝乳酶原前体cDNA,克隆测序后进行序列比对。结果表明,克隆基因为B型凝乳酶,该基因cDNA具有1292个碱基,编码381个氨基酸,包含16个氨基酸的信号肽序列和42个氨基酸的酶原序列。将其与已报道的山羊、绵羊和牛的凝乳酶原前体序列进行比对,发现核苷酸同源性分别为99.41%、98.74%和95.29%,氨基酸同源性为99.21%、98.42%和93.70%。     

中国驯鹿生长素(ghrelin)全长cDNA的克隆及序列分析

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),在本课题组已获得的驯鹿ghrelin cDNA的部分片段的基础上进行3′和5′RACE。结果成功克隆出驯鹿ghrelin cDNA的3′和5′末端序列,从而得到604bp的驯鹿ghrelin cDNA全序列,其中包含57bp 5′非翻译区(UTR)、405bp的开放读码框(ORF)、128bp的3′UTR和poly(A)14。405bp的ORF编码134个氨基酸残基的前原ghrelin(preproghrelin),其中包含41个氨基酸残基的N末端信号肽,27个氨基酸残基的成熟肽及66个氨基酸残基的C末端肽。序列同源性比较显示驯鹿ghrelin cDNA与山羊、绵羊和牛的同源性分别是92.0%、90.8%和89.5%;与猪和人的同源性分别是69.5%和65.2%;与鸡的同源性仅为33.8%。表明ghrelin的结构具有明显的种属特异性。驯鹿Ghrelin cDNA全序列的获得为进一步研究其生理作用奠定了基础。     

野猪生长激素基因的克隆与序列分析

参考家猪GH基因序列[M17704.1],设计1对特异引物,用PCR方法从野猪基因组中扩增出1条长约1.8kb的DNA片段。PCR产物经PMD18-TVector载体转化感受态DH5α株大肠杆菌,获得重组克隆子。结果表明:野猪生长激素基因DNA序列长1792bp,含完整的5个外显子和4个内含子,与家猪、牛、山羊、河马、狗、小鼠和恒河猴的GH基因cDNA序列同源性分别为99.19%、89.6%、89.7%、94.6%、92.9%、86.9%、77.3%。其cDNA所编码氨基酸与牛、山羊、河马、狗、小鼠和恒河猴同源性分别为98.74%、83.9%、83.9%、92.5%、90.7%、81.6%、65.5%。所测野猪生长激素基因序列与13个家猪品种的GH基因序列比较,检出54个核苷酸变异位点(外显子12个,内含子36个,侧翼区6个),其中24个为各家猪品种内所不具有的新变异位点,即野猪种群特有变异位点。在外显子的12个变异位点中,有8个可导致氨基酸残基的改变。这些结果,表明了野猪GH基因在进化过程中的保守性和多态性。     

牦牛生长分化因子-9基因cDNA克隆及序列分析

根据GenBank中普通牛生长分化因子9(GDF-9)基因序列(AF 307092)设计1对引物,以麦洼牦牛卵母细胞总RNA为模板,通过RT-PCR技术对牦牛GDF-9基因cDNA进行克隆测序和序列分析.结果表明:所克隆的1399 bp片段为预期的牦牛GDF-9基因cDNA序列,包含由2个外显子组成的全编码区和3′-下游部分序列.牦牛GDF-9基因编码区核苷酸序列长度为1362 bp,编码453个氨基酸,与GenBank中报道的普通牛、水牛、绵羊、山羊相应序列一致,而与人和黑猩猩存在差异.和普通牛相比,牦牛GDF-9基因编码区存在1处碱基转换(C→T),导致相应的氨基酸由丙氨酸(A)转换为缬氨酸(V).牦牛与普通牛、水牛、绵羊、山羊、人和黑猩猩的核苷酸同源性分别为99.9%、98.4%、97.0%、96.8%、85.6%和85.1%;氨基酸同源性分别为99.8%、97.1%、95.1%、95.4%、79.4%和79.5%.利用NJ法和MP法以该基因编码区核苷酸序列构建的物种间分子系统进化树结果基本一致,即牦牛与普通牛先聚为一类,再与水牛聚为一类,而后与绵羊和山羊聚为一类,最后与人和黑猩猩聚为一类.该聚类结果与物种间遗传距离大小一致,也与各物种在动物学上的分类相吻合,表明GDF-9基因编码区适用于构建物种间系统进化树.     

草地藏系绵羊心脏脂肪酸结合蛋白基因第二内含子的克隆和测序

采用PCR技术对草地藏系绵羊心脏脂肪酸结合蛋白基因第2内含子进行了扩增,扩增产物经克隆和测序显示,其长度为1 893bp,该基因片段与GenBank中普通绵羊和猪的H-FABP基因第2内含子分别有99%和66.4%的同源性。实验还对22只草地藏系绵羊H-FABP基因第2内含子中174 bp的序列进行了PCR-SSCP分析,结果未检测到多态性。     

山羊INHβB cDNA的克隆及序列分析

为了探索INHβB对山羊繁殖力影响的遗传基础,文章采用RT-PCR技术克隆出山羊INHβB cDNA序列、并使用分子生物学软件进行了序列分析.结果发现:山羊INHβBcDNA序列为1499 bp,与GenBank中牛和绵羊相同区片段的同源性达96％以上,其CDS区为1227bp,编码408个氨基酸、包含20个氨基酸信号肽、380个氨基酸成熟肽;在山羊INHβBcDNA序列中没有发现引起氨基酸变异的位点.     

狍茸顶端组织Anxa-1基因cDNA克隆及序列分析

为了初步探讨狍膜联蛋白A1(Anxa-1)基因的结构与功能,试验采用RT-PCR方法克隆得到包含全部编码区的东北狍Anxa-1基因cDNA序列,并利用生物学信息方法进行序列分析。结果表明:该基因编码346个氨基酸,相对分子质量为38 898.6,理论等电点为7.02,Anxa-1蛋白氨基酸序列与山羊、牛、猪、人、小鼠的氨基酸序列同源性分别为98%、98%、96%、94%、91%。系统进化树分析表明,在该基因座上狍与山羊、绵羊、水牛、牛等在进化上关系较近,与非洲爪蟾和非洲蟾蜍等关系较远。     

济宁青山羊BMP15基因外显子2的克隆与序列分析

本研究对高繁殖力的山羊品种济宁青山羊和低繁殖力的山羊品种内蒙古绒山羊共20只母羊的骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15, BMP15）基因第2外显子的扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析。结果表明：BMP15基因第2外显子的第3对引物扩增片段存在多态。济宁青山羊与内蒙古绒山羊相比，其BMP15基因外显子2差异由2个核苷酸和2个氨基酸改变组成，核苷酸同源性为99%。济宁青山羊与鸡、小鼠、人、猪、牛、绵羊之间BMP15基因外显子2的核苷酸序列同源性为71%～99%，氨基酸序列同源性为43%～99%。     

山羊小热休克蛋白Hspb10基因cDNA克隆及序列分析

通过RT-PCR和RACE方法克隆了山羊Hspb10基因cDNA序列并进行了序列分析。结果表明:山羊Hspb10 cDNA全长1 056 bp,编码区全长780 bp,共编码259个氨基酸,提交至GenBank数据库中,收录号为JX067553。用Clustal W方法比对不同物种氨基酸序列同源性,山羊Hspb10与牛的同源性最高,核苷酸和氨基酸序列相似性分别为93.4%和96.5%;编码氨基酸序列BLAST比对结果也表明,哺乳动物Hspb10氨基酸序列极为保守,与禽类差异较大。获得山羊Hspb10 cDNA序列,可以为分子水平上研究山羊Hspb10的生物学功能奠定基础。     

牦牛生长激素基因cDNA分子克隆及进化分析

根据GenBank中登录的牛、山羊和绵羊等动物的生长激素基因序列的比对结果,设计特异性引物,分别从甘南黑牦牛和天祝白牦牛脑垂体中提取RNA,采用RT-PCR技术克隆,测序获得707 bp的片段。结果表明:该片段包含牦牛生长激素基因完整的开放阅读框,长654 bp,编码217个氨基酸。与牛的核苷酸序列相比,牦牛第607位碱基为A,而牛为C,但这一碱基差异并未导致氨基酸残基的变化,均编码精氨酸。牦牛生长激素基因编码区序列与牛、山羊、绵羊、马、猪、猫和犬的同源性分别为99.8%、98.6%、97.7%、90.6%、90.1%、89.1%和88.9%,氨基酸序列同源性分别为100%、99.1%、98.6%、88.9%、88.5%、88.9%和89.4%,表明生长激素基因在进化上非常保守。基于CDS序列和氨基酸序列建立的系统进化树结果一致,且与比较形态学和比较生理学分类结果一致。     

绵羊IFN-γ基因的克隆与序列分析

将无菌采集的绵羊(湖羊)脾脏淋巴细胞进行体外培养,利用刀豆蛋白(ConA)刺激24 h后提取总RNA,采用RT-PCR扩增绵羊IFNγ-基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,经PCR和双酶切鉴定后进行测序。测序结果表明,扩增的cDNA全长554 bp,包含501 bp开放阅读框,编码166个氨基酸,分子质量约为18.4 ku。克隆的绵羊IFNγ-基因与GenBank上已公布的人、牛、山羊、马鹿、马、骆驼、猪、狗、猫和鸡的IFNγ-核苷酸序列进行比较,其同源性分别为75.2%,96.6%,99.0%,95.8%,83.0%,88.8%,86.6%,82.4%,53.9%和32.9%,与其他品种绵羊的核苷酸同源性为100%;氨基酸序列同源性分别为61.7%,94.6%,98.2%,92.2%,77.8%,86.8%,77.8%,76.0%,39.5%和6.7%,这为进一步研究绵羊IFNγ-基因的表达、生物学活性和应用奠定了一定基础。     

蒙古羊FSHβ基因cDNA克隆与序列分析

为了加快我国内羊产业发展,提高肉用绵羊的繁殖力,试验以蒙古羊为研究对象,以FSHβ基因作为绵羊高繁殖力的候选基因,采用RT-PCR技术对蒙古羊FSHβ基因的部分序列进行了克隆与序列分析.结果表明:克隆得到的蒙古羊FSHβ基因全长870 bp,其编码区为250 bp,共编码83个氨基酸,3'非编码区620 bp;采用DNASTAR软件分析得到FSHβ基因序列中的A、T、G、C比例分别为27.36%、21.61%、24.94%、26.09%,G+C含量(51.03%)高于A+T的含量(48.97%);通过与GenBank中其他物种的FSHβ基因cDNA序列进行同源性比较发现,蒙古羊FSHβ基因cDNA序列与牛、山羊、猪和人的同源性分别为95%、98%、92%和75%;由进化树可以看出蒙古羊与牛的亲缘关系最近,与鸡最远.     

延边黄牛白细胞介素18基因的克隆及序列分析

本试验旨在扩增延边黄牛白细胞介素18(IL-18)全长cDNA,并对其序列进行进化分析。根据GenBank中已公布的牛IL-18 cDNA序列设计1对引物,利用RT-PCR从刀豆蛋白(ConA)和植物分裂素(PHA)双重刺激36 h活化的延边黄牛脾淋巴细胞中扩增出牛IL-18全长cDNA,进行PCR、酶切和测序鉴定,并做进化分析及二级结构预测。扩增出延边黄牛IL-18全长cDNA,大小为760 bp,其中有两个氨基酸突变。进化分析结果显示,延边黄牛IL-18与牛、山羊、绵羊、马和猪的同源性较高,均大于90%,与同种群牛的同源性最高,而与原鸡的同源性最低,为51.1%。本研究确定了IL-18的种群差异,并预测了二级结构特性,为进一步研究延边黄牛IL-18的基因表达、生物活性及其作为佐剂的应用奠定了基础。     

隆林山羊ACSS2基因的克隆及序列分析

根据藏系绵羊的ACSS2基因序列设计克隆引物,并以隆林山羊肌间脂肪组织为模板克隆ACSS2基因并测序。利用在线生物信息学软件分析ACSS2蛋白的序列特性,分析不同物种间ACSS2基因的进化关系及三级结构,从而预测隆林山羊ACSS2基因的功能。结果发现,隆林山羊ACSS2基因CDS全长2 103bp,由18个外显子组成,编码701个氨基酸残基。与牛(NM_001105339)、人(NM_018677)、绵羊(XM_012114899)、小鼠(NM_019811)序列的ACSS2基因相比较,核苷酸相似性分别为97.9%、91.5%、97.6%和88.2%,氨基酸的相似度分别为98.4%、93.6%、97.4%和91.9%。其中绵羊较山羊多出13个氨基酸(G279-Q291,GKPKEKPKHIRPQ)。隆林山羊ACSS2蛋白与其他物种间具有相似的三级结构系统,且与绵羊和牛具有较近的亲缘关系,而与猪的亲缘关系较远。     

蒙古绵羊Bcl-2基因3’端 cDNA的克隆及序列分析

为扩增蒙古绵羊Bcl-2基因3’端,根据GenBank上已公布的牛的序列,设计了2条引物。从蒙古绵羊脾中提取总RNA ,采用RT-PCR 技术扩增出Bcl-2的cDNA ,并重组到PMD18-T 载体,经限制性内切酶谱分析和DNA 序列测定, 证实所克隆的cDNA 为Bcl-2,因为该cDNA 包含由261个碱基组成的开放读码框(ORF) ,该ORF 编码83个氨基酸。经比对,与牛的核苷酸序列的同源性为95.8%。     

绵羊和山羊BMP15基因FecXR突变的检测

为了检测骨形态发生蛋白15(BMP15)基因在绵羊和山羊中的突变,本研究采用PCR-SSCP方法在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊和湖羊)、山羊品种(济宁青山羊和波尔山羊)和低繁殖力绵羊品种(多赛特和特克塞尔)、山羊品种(内蒙古绒山羊和安哥拉山羊)中检测BMP15基因FecXR突变,并对小尾寒羊和济宁青山羊扩增片段进行核苷酸和氨基酸序列分析.结果表明,这8个羊品种均没有发生与Rasa Aragonesa绵羊相同的FecXR突变;小尾寒羊核苷酸序列与GenBank中绵羊BMP15序列(AF236079,NM_001114767)完全一致,济宁青山羊与小尾寒羊相比存在3处碱基不同(T529G、C530G和T576C)和2个氨基酸差异(V155G和S171P).可见BMP15基因影响Ra-sa Aragonesa绵羊高繁殖力的突变FecXR对小尾寒羊、湖羊、济宁青山羊和波尔山羊的繁殖力均没有显著影响.     

蒙古羊FSHβ基因cDNA克隆与序列分析

为了加快我国肉羊产业发展,提高肉用绵羊的繁殖力,试验以蒙古羊为研究对象,以FSHβ基因作为绵羊高繁殖力的候选基因,采用RT-PCR技术对蒙古羊FSHβ基因的部分序列进行了克隆与序列分析。结果表明:克隆得到的蒙古羊FSHβ基因全长870bp,其编码区为250bp,共编码83个氨基酸,3′非编码区620bp;采用DNASTAR软件分析得到FSHβ基因序列中的A、T、G、C比例分别为27.36%、21.61%、24.94%、26.09%,G+C含量(51.03%)高于A+T的含量(48.97%);通过与GenBank中其他物种的FSHβ基因cDNA序列进行同源性比较发现,蒙古羊FSHβ基因cDNA序列与牛、山羊、猪和人的同源性分别为95%、98%、92%和75%;由进化树可以看出蒙古羊与牛的亲缘关系最近,与鸡最远。