大豆多粒荚特异材料BAC文库的构建

利用大豆重组自交系中的一个多粒荚家系Q1001,构建了一个大豆BAC文库(bacterial artificial chromosome library)。该文库包含54912个克隆,平均插入片段达125kb,相当于大豆单倍体基因组大小的6.12倍。随机挑选4个大于100kb的克隆进行稳定性继代实验,经100代后插入的DNA片段仍然稳定存在。该BAC文库的建成,为下一步开展大豆产量相关基因的克隆打下基础。     

甘蓝型油菜-新疆野生油菜二体异附加系BAC文库的构建

甘蓝型油菜-新疆野生油菜二体异附加系包含了甘蓝型油菜全基因组和新疆野生油菜一对染色体,携带有恢复基因;以该二体异附加系为材料,以CopyControl&;#8482; pCC1BAC&;#8482; (Hind Ⅲ Cloning-Ready) Vector为载体,构建了其基因组的BAC文库（bacterial artificial chromosome library）。该文库含有69,120个克隆,平均插入片段达110kb,相当于甘蓝型油菜单倍体基因组大小的6.336倍。随机挑选3个大于100kb的克隆进行稳定性继代实验,经100代后插入的DNA片段仍然稳定存在。该材料BAC文库的建成,为我们下一步开展甘蓝型油菜基因组学研究及相关重要功能基因的克隆等提供了必要的技术平台。     

新疆野生油菜BAC文库的构建

本实验以新疆野生油菜18号的基因组DNA为材料构建了其BAC(bacterial artificial chromosome)文库。该文库共有14592个克隆,插入片段在50-300kb之间,平均插入片段105kb,空载率低于5%,覆盖了新疆野生油菜基因组约4.0倍。新疆野生油菜基因组BAC文库的构建,为进一步研究其基因组结构及功能基因的利用等奠定了基础。     

细菌人工染色体(BAC)文库及其在小麦中的应用

细菌人工染色体（BAC）具有容量大、遗传稳定、易于操作等优点，在基因组研究和基因功能分析等方面得到了广泛应用。对BAC文库克隆载体的类型、小麦BAC文库的构建及其应用进行了综述，并对其前景进行了展望。细菌人工染色体载体是由大肠杆菌的F-因子发展而来，第一代BAC克隆载体pBAC1081能容纳300kb的片段，但它只具有转化选择标记．没有重组选择标记。第二代载体是将LacZ基因插入到多克隆位点中形成具有重组选择标记类型的载体如pBeloBACll，在该载体的基础上经过改造和改进又发展了一些特殊用途的载体，如富集基因类型和遗传转化类型的载体。近年来利用这些载体构建了小麦二倍体、四倍体、六倍体基因组BAC文库以及小麦特定染色体BAC文库，井以单克隆或混合池的形式保存。这些小麦BAC文库对于小麦基因克隆、基因组及基因区物理图谱的构建以及比较基因组学等方面的研究具有重要的意义。     

一种获得大片段克隆的SMART全长cDNA 文库构建方法

针对SMART方法中PCR扩增削减了大片段基因所占比例,使文库中很难获得大片段克隆的问题,进行了方法改进.在原始SMART方法的基础上,以大豆叶片为材料,通过琼脂糖凝胶分级分离技术,将PCR扩增后合成的dscDNA分成3个等级,分别与载体连接、转化,构建相应亚库,每个亚库容量在1.0×106左右,重组率接近99%.改进方法所建文库的平均全长率53.6%,与改进前的(52.2%)相当.插入片段范围为0.5～3.5kb,最大插入片断长度比改进前的提高1.5kb.该方法提高了SMART方法中大片段克隆的获得率,为大豆功能基因组学研究提供了保障.     

小麦BAC shotgun测序文库的构建

为给小麦基因组中某一基因区域的测序与分析奠定基础,以小麦7B和7D染色体上的10个BAC克隆为材料,运用Large-Construct Kit和TOPO TA cloning kit两个商品化的试剂盒及HydroShearDNA剪切仪建立了BAC shotgun文库构建的技术体系,即利用该体系可以获得高纯度的BAC 20-50μg以及DNA 3-5 kb的目标小片段,5-20 min即可完成连接,一次转化可获得2000个重组克隆。利用这一方法,现已构建了10个小麦BAC shotgun文库,这些文库可为小麦基因组特定区段的研究奠定基础。     

茶树新梢cDNA文库的构建和ESTs测序成功率初步分析

报道了国内第一个茶树cDNA文库的构建及其EST测序成功率分析。以Trizol一步法从龙井43春茶新梢中提取总RNA,分离纯化富含Poly (A)的mRNA,LD-PCR反转录合成双链cDNA,以λTripEX2为载体,构建了龙井43新梢cDNA文库。以XL1-Blue为受体菌测定原始文库的滴度为6.8×10⁵ pfu/ml,总克隆数为3.5×10⁵个,重组率为98.05%,扩增后文库总滴度为7.2×10⁹ pfu/ml。对随机挑取的噬菌斑进行PCR鉴定,表明插入片段大多分布在0.5-2.0 kb之间,绝大部分在1.0-1.5 kb左右。文库质量鉴定结果表明,构建的茶树新梢cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。对4320个克隆的序列测定表明,获得有用序列2963个,测序成功率为68.5%,剔除短序列后,首批共获得1687个茶树ESTs。     

石麦15细菌人工染色体文库构建与鉴定

为给小麦功能基因研究提供参考信息,以冬小麦栽培品种石麦15(Triticum aestivum L.)为试材,从暗培养7~10d的黄化幼苗地上部提取高分子量基因组DNA,使用载体pCC1BAC的HindⅢ位点构建了六倍体小麦细菌人工染色体文库。该文库由1 000 000个以上克隆组成,保存在1 020个混合池中,克隆插入片段平均大小为85kb,空载率为2.5%;覆盖小麦基因组5倍以上;挑取7个克隆培养5d后,经HindⅢ完全酶切检测,其指纹图谱稳定一致。石麦15细菌人工染色体文库的构建为小麦基因克隆、调控序列克隆以及比较基因组学研究奠定了基础。     

高低含油量大豆成熟期胚抑制消减 cDNA文库构建及其差异表达基因分析

利用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization, SSH）技术,以高含油量大豆品种“中豆32”和低含油量大豆品种“油春02-6”36天胚为实验材料构建消减cDNA文库。文库的插入片段集中在500bp左右，挑取766个克隆进行PCR筛选获得700个阳性克隆，经过点杂交筛选后选择了575个阳性克隆进行测序。经过同源性比对归并后得到237个差异表达基因，除10个未知基因外，其余涉及到蛋白贮藏、蛋白质降解、激素调节等多个方面。本文还对部分可能与油脂合成相关的差异表达基因进行了RT-PCR半定量和荧光定量PCR检测，并简要讨论了它们的功能，为进一步研究这些基因在大豆油脂合成过程中的作用奠定了基础。     

芥菜型油菜A9染色体BAC物理图谱构建及比较基因组分析

为获得高精确度的芥菜型油菜A9染色体物理图,本研究利用定位在A9染色体上的标记对芥菜型油菜BAC文库进行三维混合PCR筛选,共得到阳性BAC 3200个;构建了由16个重叠群、5个单拷贝组成的芥菜型油菜A9染色体物理图谱。根据最小路径原则挑选代表整个物理图的种子BAC 435个,并进行双末端测序,得到质量良好的序列862条;按照BAC平均插入片段为126 kb,可知所有重叠群累积达52.08 M,覆盖A9染色体的1.37倍。利用BLAST软件(按参数值E1e-10)将种子BAC末端序列比对到白菜和甘蓝型油菜A9染色体假分子上,结果显示该物理图谱分别覆盖了36.4、31.0 Mb的物理距离,相当于全基因组组装长度的93.9%、91.8%;在862条BESs中,分别有702条(81.40%)定位在白菜A9染色体上,646条(74.9%)定位在甘蓝型油菜A9染色体上,表明芥菜型油菜A9染色体同白菜A9染色体同源性高于甘蓝型油菜A9染色体;芥菜型油菜A9染色体同甘蓝型油菜A9染色体,相对白菜A9染色体6413031~7827177、14856710~18458808的位置发生了两处相同的分别长为1.4、3.6 Mb的倒位,白菜和芥菜型油菜A9染色体相对于甘蓝型油菜15676847~16064302的区域存在长为0.98 Mb的插入片段,该区域位于前述的倒位区域,而且与预测但未组装出的甘蓝型油菜着丝粒位置一致。     

甘蓝型油菜矮化突变体抑制消减cDNA文库 的构建及初步分析

采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术，以甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”为实验方（tester），野生型“3529”为驱动方（driver）构建植株差异表达的抑制消减cDNA文库。所建cDNA文库的插入片段大小主要集中在100 bp~1000 bp之间。斑点杂交筛选得到了32个阳性克隆，序列测定和同源性对比分析表明，其中的12个克隆功能未知，其余涉及到激素信号转导、第二信使、光合作用、脂肪酸代谢及衰老等多个方面。还对部分差异表达基因的功能进行了分析。为进一步认识油菜植株矮化的机理奠定了基础。     

接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

利用Trizol法提取接种PRsv 4 d的番木瓜种苗总RNA,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,双链cDNA末端经Pfu-DNA聚合酶补平,与EcoR I接头连接,XhoI酶切消化产生粘端.用Sepharose CL-2B柱分离纯化去除小分子cDNA片段,再与pMyr酵母表达载体连接,转化受体菌XL10-Gold,构建了接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库.所获得的原始文库的克隆总数为1.8×106cfu,重组率为100%,文库滴度为2.6×109cfu/mL.对随机选取的34个克隆进行PCR鉴定,结果表明插入片段长度均大于O.5 kb且集中在1 kb左右.文库质量鉴定结果表明,该文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段.     

花生种子全长cDNA文库的构建和鉴定

以花生品种闽花5号各发育时期的种子为材料分离mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA。利用限制性内切酶SfiⅠ酶切。将经过分级分离得到的cDNA连接到质粒载体pDNR-LIB,成功构建花生种子全长cDNA文库。将所得到初级文库扩增后进行保存,检测扩增文库滴度为1.7×109cfu/mL。PCR鉴定重组子,发现重组率接近100%,插入片段集中分布在0.5~2.0 kb。插入片段的平均大小在1000 bp左右,这说明该文库既可以满足低丰度基因的筛选,也可保证获得全长cDNA。     

强优势玉米杂交种雌穗均一化cDNA文库的构建与鉴定

以强优势玉米杂交种豫玉22发育时期的雌穗为材料构建cDNA文库,为进一步研究和分离杂种优势相关基因构建技术平台。选择玉米雌穗发育过程中的4个时期(生长锥伸长、小穗分化、小花分化和花丝始伸期)的雌穗组织分别构建了4个定向cDNA文库,依据基因组DNA饱和杂交的原理,将从4个独立的cDNA文库中提取的质粒混合,通过基因组DNA亲和体系饱和杂交,获得雌穗全发育时期均一化cDNA文库。该文库平均插入片段1.3kb,含有3×104个克隆。对文库中随机的150个克隆进行测序,81.6%的序列为非冗余序列,11.2%的序列含有两个或两个以上的拷贝,并且主要来自多基因家族转录本,说明此文库的均一化有效。对测序结果进行功能聚类分析,发现文库序列涉及水解酶、转移酶、核苷酸结合蛋白、蛋白激酶、转录因子等基因,涉及环境应答、蛋白代谢、物质转运、个体发育等多个生化途径,说明该均一化文库基因覆盖度较高。该文库还包含有大量的未知基因,有待进一步的发掘和研究。     

同一SSR引物在不同棉种BAC文库中的筛选及其FISH分析

本实验室前期利用SSR引物NAU1201筛选海岛棉Pima 90-53 BAC文库，其中BAC克隆299N22含有特殊的重复序列。本试验用SSR引物NAU1201分别在阿非利加棉文库和达尔文氏棉文库中筛选到3个和1个阳性BAC克隆。这些BAC克隆在A（亚）组所有的染色体上均有弥散的杂交信号，而在D（亚）组所有的染色体上几乎没有杂交信号，这与海岛棉文库BAC克隆299N22的FISH结果一致。相似的FISH杂交信号说明这些BAC克隆极有可能均含有相同的重复序列。这些BAC克隆的获得为研究该重复序列在不同棉种基因组中的分布情况以及序列差异提供了物质基础。     

芥菜型油菜A09染色体BAC重叠群的构建及分析

利用定位在芥菜型油菜A09染色体上的分子标记对芥菜型油菜（Brassica juncea）ZBjuH BAC文库进行PCR步移筛选。共筛选出725个BAC,测定了315个BAC的末端序列,获得564条BAC末端序列,BLAST分析表明这些末端序列对应白菜（Brassica rapa）基因组序列支架45、支架81、支架40,支架134、支架145和支架59的同源区域,构建了芥菜型油菜A09染色体大约6.3 Mb的BAC重叠群,为芥菜型油菜A09染色体物理图谱构建奠定了基础。     

花生球蛋白基因片段的克隆

为克隆花生贮藏蛋白基因建立了花生未成熟种子的cDNA文库。根据大豆贮藏蛋白的保守区设计特异引物，从花生cDNA文库中扩增出450bp的特异性产物。经过测序分析表明与大豆球蛋白各亚基基因的同源性均达90％以上，说明已得到花生球蛋白基因的cDNA片段。该片段可以作为探针从cDNA文库中筛选花生球蛋白基因的cDNA全序列。     

Xa21基因的分子生物学研究进展

 介绍了水稻抗白叶枯病害基因 Xa21的分子生物学研究进展。Xa21定位于水稻第11号染色体上, 与分子标记RG103,以及PCR产物RAPD248、RAPD818等紧密连锁, 利用标记RG103作探针已从细菌人工染色体(BAC)和粘粒文库中克隆出包含 Xa21基因位点的9.6 kb Kpn Ⅰ片段, 该片段包含一个3075 bp的开放阅读框, 中间有一个843 bp的内含子。Xa21基因产物为一1025个氨基酸的受体蛋白, 具有LRR和STK区,结构与Cf-9、N、PTO等蛋白相似,其抗病分子机制尚不太清楚。     

大豆细胞质雄性不育系配套保持系线粒体基因组BAC文库的构建

以大豆细胞质雄性不育系配套保持系材料(JLCMSl)的黄化苗为材料,纯化得到线粒体.低熔点琼脂糖包埋线粒体成胶块,消化裂解后用HindⅢ部分酶切,通过脉冲场电泳回收40～60kb酶切片段.将回收产物连接到载体pIndigo-BAC 5,通过电击转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,获得的BAC文库包含2 000个单克隆,平...     

低温诱导东乡野生稻幼苗期叶片cDNA文库的构建和鉴定

从8℃低温诱导的东乡野生稻幼叶中提取总RNA,以总RNA为模板,利用SMART技术合成第1链,再经LD-PCR扩增合成第2链后,将获得的双链cDNA与双元表达载体YPL3连接,重组质粒电转入大肠杆菌,成功构建了东乡野生稻cDNA文库。经测定,原始文库滴度平均为4.4×107cfu/mL,平均插入片段约1kb,重组率为100%,符合cDNA文库构建要求,为后续利用酵母功能互补技术筛选东乡野生稻有利基因奠定了基础。