茶树基因芯片的研制和初步应用

利用EST计划获得的1β680个基因片段,制备了国内外首张茶树cDNA芯片,芯片上每个基因设置一个重复,共含有6β912个点,其中6β720个靶基因,160个阳性对照,32个阴性对照。4×4矩阵点制,共两个区域,每个区域的芯片密度为1β037点/cm²,每张芯片可进行两次杂交。用3个茶多酚含量有差异的品种与芯片进行了杂交,获得了不同品种的基因表达谱及表达差异的基因;选取其中2个与茶叶香气密切相关的基因,采用荧光定量PCR的方法进行了验证,基因表达变化趋势与芯片检测结果一致,验证了cDNA芯片杂交结果的可靠性。该芯片可以进一步应用于许多茶学研究领域,进行基因表达差异的高通量检测。     

与甘蔗抗黑穗病性相关的14-3-3基因的克隆和表达分析

为了解14-3-3基因在甘蔗黑穗病抗性中的作用,本研究以课题组前期构建的甘蔗抗黑穗病抑制消减杂交文库中筛选出的1个与14-3-3基因同源的EST序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR方法从甘蔗ROC22品种中分离到1个Sc14-3-3基因(Gen Bank Accession Number:KJ577592),并对其序列信息和基因表达情况进行分析。结果显示,该基因ORF长771 bp,编码256个氨基酸残基;Sc14-3-3是定位于细胞质的亲水蛋白,无跨膜螺旋区及信号肽,有10个Ser、3个Thr和7个Tyr潜在的磷酸化位点,并在N-端有4个蛋白结合区和1个多核苷酸结合区,对翻译和能量新陈代谢起着重要作用;该蛋白属非ε类群,其N-端和中间区域在不同物种间相对保守,C-端差异相对较大。基因表达模式分析显示,Sc14-3-3基因可能参与甘蔗对生物逆境的细胞免疫响应,其对Me JA介导的信号途径应答较SA和ABA早;黑穗病菌胁迫下,Sc14-3-3基因在甘蔗抗感品种中的表达模式存在差异,其在抗黑穗病品种YC05-179中上调表达且表达量变化明显,揭示了该基因参与甘蔗对黑穗病的应答反应。以上结果为甘蔗Sc14-3-3基因的功能研究积累了一定的基础资料,并为今后甘蔗的抗病分子育种提供后备基因资源。     

甘蔗割手密种和热带种基因差异表达的基因芯片和Solexa高通量技术的比较分析

分别采用甘蔗表达谱芯片和Solexa技术,对甘蔗热带种和割手密种基因表达谱进行分析.结果表明:基因芯片技术筛选得到1 245个差异表达基因；Solexa技术分别在热带种和割手密种中得到42 913 194个和39 363 668个初始tag,从中获得143 121和112 281个高质量测序标签(clean tags),对应的标签种数(distinctclean tags)分别为25 164和20 349,未知序列(unknown clean tags)分别为117 957和91 932,其中差异表达基因有l 432个.基因芯片和Solexa技术得到的差异基因中有823个是相同的,主要涉及非生物刺激响应、磷代谢、转录调控等功能.     

水稻WRKY转录因子基因家族响应外源一氧化氮的表达谱分析

一氧化氮(nitric oxide,NO)信号分子与WRKY转录因子均参与植物抗逆、发育与代谢等许多生理过程。采用Agilent水稻全基因组cDNA芯片分析了NO处理后1、6和12h水稻幼苗WRKY转录因子基因的表达谱,鉴定出在1个时间点有两倍或两倍以上表达变化的WRKY基因32个,主要分布在WRKY的Ⅰ和Ⅱ组,其中75%的Ⅱa和45.6%的Ⅱd亚组成员为差异表达基因;鉴定出至少在2个时间点有两倍或两倍以上表达变化的WRKY基因15个,均为早期(1h)应答,且多数(64.2%)持续上调;基因功能预测分析表明,这些基因主要参与生物学过程中的细胞过程、代谢过程和刺激响应,以及分子功能中的转录调节活性和结合;代谢通路分析表明,WRKY24涉及植物与病原菌相互作用代谢通路。实时荧光定量PCR验证结果与芯片杂交结果基本一致,印证了芯片杂交结果的有效性。上述发现提示,NO信号可能参与了WRKY转录因子介导的生物学调控功能,并为这些基因的进一步功能分析奠定基础。     

受白粉菌诱导表达的簇毛麦草酸氧化酶基因(Hv-OxOLP)的克隆和分析

为了筛选抗白粉病基因Pm21介导的抗病途径中的防卫基因，采用芯片杂交技术筛选携带或不携带Pm21基因的材料之间或抗病材料经白粉菌诱导与非诱导样品之间的差异表达基因，并采用RT-PCR方法分析了被筛选出的草酸盐氧化酶类似蛋白基因（Oxalate Oxidase Like Protein，OxOLP）的表达情况，进一步利用TAIL-PCR方法分离簇毛麦基因Hv-OxOLP中的全长序列。芯片杂交结果表明，探针Contig3156（一个推导的草酸盐氧化酶类似蛋白基因）在抗病簇毛麦中受白粉菌诱导的程度最大，在抗病易位系中该探针的杂交信号比在感病扬麦5号中的杂交信号强。半定量RT-PCR结果表明，在抗、感白粉病的材料中草酸盐氧化酶类似蛋白基因都受白粉菌诱导表达，但在抗病材料中达到表达峰值的时间早。用TAIL-PCR方法分离的Hv-OxOLP有一个内含子和两个外显子，ORF包含690个核苷酸，在启动子区包含两个W-box，在终止密码子后面还有一个polyA的加尾信号。作为一个受白粉菌诱导表达的基因，HpOxOLP在抗白粉病反应中可能起重要的作用。     

利用oligo芯片技术鉴定橡胶树死皮相关基因

橡胶树死皮（Tapping Panel Dryness,TPD）是天然橡胶单产提高的主要限制因子之一,给橡胶种植业带来严重危害。本研究利用定制橡胶树oligo芯片,通过提取死皮和健康橡胶树胶乳总RNA,标记并反转录成cDNA后与橡胶树oligo芯片进行杂交鉴定TPD相关基因,利用RT-PCR技术对芯片结果进行验证。对芯片数据分析结果显示,以2倍标准在死皮与健康橡胶树间筛选到26个差异表达基因,其功能涉及橡胶生物合成、细胞程序性死亡、细胞抗性及防御反应、活性氧代谢、DNA甲基化、泛素-蛋白酶体、信号传导、蛋白质合成、加工及转运等调控途径。进一步的RT-PCR验证结果表明,随机选取12个基因的表达模式均与芯片结果一致。本研究为大规模鉴定TPD相关基因和揭示TPD发生分子机制奠定了基础。     

甘蔗苏氨酸脱氨酶基因的克隆与表达分析

应用电子克隆技术,以烟草AAG59585序列为探针,获得了甘蔗苏氨酸脱氨酶(threonine deaminase)基因的全长cDNA,命名为ScTD。经RT-PCR扩增和验证,该基因序列与电子克隆结果一致性高达99%。序列分析结果表明:ScTD基因全长2 120 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,164~1 681 bp),编码505个氨基酸,该基因编码蛋白定位于微体,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构原件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要在氨基酸合成中发挥作用。电子表达分析结果显示,该基因在甘蔗根尖、根颈、花序、叶片、全株、芽和茎中组成型表达,其中在花序和根中的表达量最高。荧光定量PCR结果分析表明:该基因在甘蔗各组织中均有表达,且在根中的表达量最高。此外,该基因的表达受水杨酸胁迫后表达量最高,约为对照组的43.16倍,其次为聚乙二醇和茉莉酸甲酯,分别为6.90倍和4.40倍,推测该基因的表达与甘蔗抗病虫和抗渗透胁迫有关。此结果为甘蔗ScTD基因的克隆和功能验证以及在甘蔗基因工程中的应用奠定基础。     

甘蔗脱毒健康种苗中蔗糖合成酶基因差异表达分析

甘蔗种苗经过脱毒处理能够提高甘蔗生物量和糖分,而蔗糖合成酶是甘蔗生长和蔗糖积累的关键性酶。本文分析了2种甘蔗蔗糖合成酶基因SUS4和SUS7在脱毒种苗和常规种苗全生育期的表达量差异。结果表明,SUS4和SUS7在整个生育期叶片和未成熟茎秆中差异表达,苗期是下调表达,其它时期是上调表达,在拔节期成熟茎秆SUS4和SUS7上调表达,而在成熟期成熟茎杆中SUS4和SUS7下调表达,说明蔗糖合成酶基因在脱毒处理过程中,对不同类型蔗糖合成酶基因的时空表达特性的影响不同,而不同的生育期可能不同的蔗糖合成酶基因所起生理功能不同,形成一种相互调控的的基因网络,最终有利于甘蔗产量的形成和蔗糖的累积。     

甘蔗二氨基庚二酸异构酶基因的克隆与表达分析

以水稻ABA99594序列为探针, 使用电子克隆技术, 获得甘蔗二氨基庚二酸异构酶基因（Diaminopimelate epimerase, DAPE）的1条cDNA全长序列,命名为ScDAPE。经RT-PCR扩增和序列分析验证后, 该基因序列与电子克隆结果一致, 基因全长1 168 bp, 包含1个816 bp的开放阅读框, 编码271个氨基酸残基, 生物信息学分析预测该基因编码蛋白定位于内质网膜, 为可溶性酸性蛋白, 无信号肽, 二级结构元件多为无规卷曲, 含有2个保守功能域, 主要功能为氨基酸合成。电子表达分析结果显示, 该基因在甘蔗侧芽、 花序、 叶片和顶端分生组织中均有表达, 花序中的表达量最高, 且该基因的表达受温度调控。荧光定量PCR分析结果表明,该基因在甘蔗根、 蔗髓、 蔗皮、 侧芽、 叶片、 叶鞘中均有表达, 且在根中的表达量最高。此外, 该基因的表达受水杨酸（salicylic acid, SA）、 脱落酸（abscisic acid, ABA）、 茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）、 模拟干旱（PEG）、 高盐（NaCl）和氯化镉（cadmium chloride, CdCl2）的胁迫诱导, 其中受水杨酸胁迫后表达量最高, 约为对照组的12.4倍, 其次为聚乙二醇, 约为对照组的2.72倍, 推测该基因的表达与甘蔗抗病性和抗渗透胁迫有关。研究结果为甘蔗中不同DAPE基因的克隆和功能验证以及甘蔗ScDAPE基因在甘蔗基因工程中的应用奠定了一定的基础。     

水稻叶绿体ATP合成酶基因转录丰度受赤霉素诱导调节

 采用mRNA差异显示技术分离和鉴定了水稻受赤霉素诱导的差异表达基因。经50个引物组合差异显示，获得21个诱导表达差异的cDNA片段。经反向Northern初步筛选对其中5个阳性片段进行克隆及序列分析。其序列经国际联网BLAST查询表明编号为GA21C的为水稻叶绿体ATP合成酶基因片段。Southern杂交结果证实此基因为单拷贝。Northern杂交结果显示确受赤霉素诱导表达且在诱导16 h后达到高峰，表明赤霉素诱导水稻产生生理反应过程涉及叶绿体基因表达。     

玉米穗粒腐病差异表达基因的生物信息学分析

结合基因功能分类体系(Gene Ontology,GO)对筛选得到的玉米穗粒腐病差异表达基因片段进行全面生物学功能注释。以抗玉米穗粒腐病的自交系Bt-1为材料,接种串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme),对接菌后96 h的玉米苞叶样品以玉米全基因组基因芯片进行大规模筛选,利用分子注释系统(Molecular Annotation System,MAS)对筛选得到的基因片段进行GO分子功能注释,分析特征基因的功能。结果表明,利用基因芯片从抗性材料Bt-1中获得的482条差异代表序列,GO注释获得大量重要信息,对应的基因注释包括分子功能、生物过程和细胞组分3个层次。GO能够准确预测与玉米穗粒腐病相关抗病基因的功能,对于了解表达基因之间的相互关系和深入挖掘、理解高通量数据等方面的具有重大帮助,是研究抗病基因不可或缺的生物学信息手段。     

大豆短日照诱导下新ESTs序列的筛选和功能推测

本研究对大豆短日照诱导的基因表达差异进行了比较基因组分析,在细胞分子水平上从基因差异表达的角度研究短日照诱导衰老过程中基因转录物丰度的变化,探索大豆衰老的复杂机制。利用本实验室已经获得的抑制性消减杂交第二次PCR扩增产物重新构建新的cDNA文库,继续筛选差异表达的ESTs。利用BLAST 软件在GenBank 数据库进行序列相似性比对,发现28个与暗诱导相关的差异表达新ESTs,归类并推测其参与机体暗适应上调表达的蛋白质功能,为进一步分离暗处理诱导表达的基因,揭示短日照加速衰老的作用机理提供基础数据。     

Molecular Markers for Sweet Sorghum Based on Microarray Expression Data

Using an Affymetrix sugarcane genechip, we previously identified 154 genes differentially expressed between grain and sweet sorghum. Although many of these genes have functions related to sugar and cell wall metabolism, dissection of the trait requires genetic analysis. Therefore, it would be advantageous to use microarray data for generation of genetic markers, shown in other species as single-feature polymorphisms (SFPs). As a test case, we used the GeSNP software to screen for SFPs between grain and sweet sorghum. Based on this screen, out of 58 candidate genes, 30 had single-nucleotide polymorphisms (SNPs) from which 19 had validated SFPs. The degree of nucleotide polymorphism found between grain and sweet sorghum was in the order of one SNP per 248 base pairs, with chromosome 8 being highly polymorphic. Indeed, molecular markers could be developed for a third of the candidate genes, giving us a high rate of return by this method.     

甘蔗EST-SSR标记的开发和多样性分析

运用生物信息学分析方法对甘蔗(Saccharum spp.)的282 809条表达序列标签(ESTs)进行分析,共获得Unigene 138 590条,发掘出分布于10 086条Unigene的10 505个微卫星(EST-SSR)位点,SSR发生频率为7.26%,平均9.22 kb出现1个SSR。在7个杂交甘蔗品种中,三核苷酸基元的SSR数量最多(74.95个/Mb),其次为二核苷酸基元的SSR(22.95个/Mb),二者占总数的90.27%。以CCG/CGG、AG/CT为重复基元的SSR是最常见的EST-SSR类型,富含G/C的EST-SSR占据极明显的优势。与拟南芥和水稻cDNA序列内SSR的比较表明,富含G/C的SSR可能是禾本科植物SSR的一个共同特点。研究发现,SSR在EST与基因组序列之间以及在不同甘蔗品种之间的分布存在差别,具有丰富的多样性。此外,从EST数据分析获得杂交甘蔗品种的16个保守基因,从中发掘了9个SSR位点。最后,利用Primer3和e-PCR软件设计了一批具有物种特异性和通用性的EST-SSR PCR引物,相关数据可以通过http://59.50.66.49/SSR/sugarcane/sugarcane.EST-SSR.tgz链接从因特网下载。该研究结果可为开展甘蔗遗传多样性分析、种质资源鉴定和分子辅助育种提供参考。     

玉米抗寒基因的克隆与表达研究

用DDRT-PCR技术研究玉米自交系承18在常温和不同低温处理下基因表达的变化,分离了10条差异表达的cDNA。序列分析结果表明:其中部分与前人克隆的抗逆cDNA同源,部分与信号传导相关基因同源,部分与功能未知的cDNA同源。用Northern杂交方法对差异片段MCI16做了进一步鉴定,同时还对玉米Cat3、拟南芥CBF1和FAD3基因在不同低温处理的玉米幼苗中的表达特性进行了研究,结果表明:MCI16、Cat3等基因受低温的诱导表达,对提高玉米的抗寒力起积极作用。     

花生种皮抗黄曲霉差异基因表达初步分析

黄曲霉不同抗性花生种皮存在显著差异，本试验选择经鉴定的高抗黄曲霉花生种质J11与高感种质金花1012为研究材料，以金花1012为对照利用基因芯片技术开展了抗病差异基因表达分析研究。试验共使用61078杂交探针组，结果表明，共有417个差异基因表达量上升，650个差异基因表达量下降。另外．获得抗Phytophathora Sojae真菌病害表达量上升差异基因4个，表达量下降差异基因49个。获得抗Heterodera Glycines Ichinohe真菌病害表达量上升差异基因4个，表达量下降差异基因25个。     

cDNA微阵列检测萌发期水稻重要代谢基因表达模式

使用含2200条水稻表达序列标签的cDNA微阵列检测了萌发期水稻胚芽、胚轴（含糊粉层和盾片）、胚根的基因表达模式,得到1032个有效的基因表达数据。其中,在胚芽、胚根、胚轴中特异表达的基因数分别为55、106和36个。以胚轴为参比,70个基因在胚芽、胚根中均表达上调,包括延伸因子1和多个核糖体蛋白基因,这些基因与顶端生长点的细胞分化和生长有关。胚轴特异表达的基因有36个,大部分参与胚乳贮藏物质的代谢,如聚泛蛋白基因、磷酸甘油酸激酶基因等。     

低磷胁迫柱花草差异表达基因分析研究

研究柱花草在低磷条件下生长的分子机理和反应机制。采用cDNA-SRAP分子标记技术分离柱花草茎和叶在低磷胁迫下相关基因的差异表达片段,并对其进行生物信息学分析。结果表明,8对引物组合共扩增出差异片段195条,其中抑制型表达片段56条,诱导型表达片段92条,上调表达型差异片段36条,下调表达型片段11条,大小均在50~1000 bp之间。二次扩增后将特异性条带回收后进行测序,通过BLAST比对,共比对出14条差异片段的同源序列,其中8个差异表达的核苷酸序列与已知功能基因（JCVI-FLLj-1K4未知mRNA、NBS-LRR型抗病蛋白、ATP合成酶、醛固酮还原酶、叶绿体RF2）有较高同源性,5个序列与假定基因或预测基因（UPF0051蛋白、蛋白酶启动子、SCEI结合酶、吲哚-3-丙酮酸盐单氧酶）同源性较高。本研究为筛选柱花草响应低磷胁迫的差异基因提供参考。     

小麦LBD基因家族的全基因组鉴定、表达特性及调控网络分析

为深入发掘小麦LBD基因的功能,利用小麦最新基因组数据,通过生物信息学手段,对小麦LBD基因家族进行了鉴定,并对其表达特性及调控网络进行了分析。鉴定结果表明,本研究得到了75个小麦LBD基因,根据系统进化分析结果,可将它们划分为ClassⅠ和ClassⅡ两个亚家族。染色体定位结果表明,除了5D和7D外,其余染色体均含有LBD基因。共表达调控网络分析表明,15个LBD基因参与了小麦功能基因调控。利用RNA-seq数据对所有小麦LBD基因在不同组织以及不同逆境胁迫下的表达情况进行分析表明,小麦LBD基因在不同组织间和胁迫下存在着差异表达,多个组织特异和胁迫响应相关LBD基因被鉴定到,可作为后续功能研究的候选基因。     

西藏青稞品种藏青13高氮处理的SSH文库构建及分析

为了分析青稞高氮处理相关基因的表达,以藏青13为实验材料,通过抑制差减杂交构建了青稞高氮处理下的差减c DNA文库。在随机挑取的281个阳性克隆中,测序获得219条高质量的EST,含有212条非重复且与Genbank中的基因或蛋白具有较高的同源性的序列。对其进行Blast2Go功能注释可将差异表达的基因定位到细胞组件、分子功能和代谢过程3大类内。通过KEGG代谢途径分析,212个比对结果中的117个ESTs有详细的KO功能注释,定位到17个具体的代谢途径上,且主要定位在光合作用碳固定途径和氮素代谢途径。此外,分析还发现这些基因主要是编码参与结构和功能代谢合成途径中的一些酶,且参与信号转导、转录调节和光合作用等生理过程,说明这些基因很可能参与到青稞在高氮处理下的抗性反应中。