柑橘脉突病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用

为了快速、灵敏地检测柑橘脉突病毒(Citrus vein enation virus,CVEV),通过设计特异性引物(EVq F4/EVq R4),优化反应条件,建立了CVEV的实时荧光定量RT-PCR检测体系。该方法特异性良好;检测灵敏度比常规RT-PCR高100倍;标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.992,扩增效率101.8%;检测组内和组间变异系数均小于2.85%,重复性较好。利用所建立的实时荧光定量方法对柑橘植株进行检测发现,‘代代酸橙’和‘象山红’植株中CVEV分布不均匀,其中根部病毒滴度最高,分别为162.52和45.32拷贝·ng~(-1) RNA,皮及叶部病毒滴度相对较低。     

T3基因型柑橘衰退病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立及应用

根据不同基因型柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）ORF1a的序列差异,设计T3基因型CTV的特异性引物T3-4F/R,通过优化得到最佳反应条件建立T3基因型CTV分离株的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR,并进行灵敏性、重复性试验。应用该方法测定柑橘植株中T3基因型CTV分离株含量。建立了一种特异性检测T3基因型CTV分离株的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法,其灵敏性比普通RT-PCR方法高100倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为97.1%,相关性系数为0.992。组内和组间变异系数均小于2.94%,表明该方法重复性好。田间样品中T3基因型CTV含量差异较大,最高含量是最低含量的1 250倍。本研究中建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法能够准确检测柑橘植株内的T3基因型CTV分离株,可用于研究T3基因型的CTV的变化规律。     

马铃薯5种病毒多重PCR检测技术的建立及应用

采用多重RT-PCR方法,建立可同时检测马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯A病毒（PVA）和马铃薯S病毒（PVS）的方法。根据 GenBank中PVX、PVM、PVY、PVA及PVS（CP）基因序列设计特异引物,对多重RT-PCR退火温度、循环次数、延伸温度、引物组合浓度进行优化,建立了能同时检测5种马铃薯病毒的多重RT-PCR方法。该方法能同时扩增出PVX、PVM、PVY、PVA及PVS特异片段,其大小分别是138、213、369、468和657 bp。测序结果表明,5种病毒的序列与相应参考序列相似性达到97%以上。灵敏度分析结果表明,多重RT-PCR方法能够检测植物组织量为10-3 mg。应用建立的多重RT-PCR检测方法对田间样品和组培苗进行检测,结果显示,该方法可以准确、快速、灵敏地同时检测单一或复合侵染的5种马铃薯病毒。     

葡萄扇叶病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据葡萄扇叶病毒（Grapevine fanleaf virus,GFLV）RNA2序列设计4对特异性引物,通过引物筛选、体系优化,建立了以FL-HP1-F/R为引物的GFLV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。该方法标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为100%,相关性系数为0.998,灵敏性分别是常规RT-PCR和巢式RT-PCR的100倍和10倍。重复性试验表明组内和组间变异系数均小于2.59%,显示该方法具有较好的检测稳定性。内参基因的稳定性测试结果表明葡萄EF1和GAPDH基因具有较好的试验稳定性。利用建立的荧光定量方法测定12个葡萄样品中GFLV含量,并检测58个葡萄样品,结果表明不同葡萄样品中GFLV含量差异较大,最高含量是最低含量的81 245.5倍,与ELISA和巢式RT-PCR相比,实时荧光定量方法能检测出更多的GFLV分离物。     

苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus,ASPV）的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,根据ASPV外壳蛋白基因（coat protein,cp）保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA为标准品构建标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。建立的标准曲线决定系数达0.996,扩增效率为99%;该方法特异性好,与苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果锈果类病毒（ASSVd）均无交叉反应;其最低检测限为1.31 × 102 copies ? μL-1,灵敏度比常规RT-PCR高100倍;批内和批间变异系数均小于1.85%。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,适用于田间样品中ASPV的快速定量检测。     

运用实时荧光RT-PCR技术检测柑橘碎叶病毒

柑橘碎叶病是由橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)引起的一种重要的柑橘病害,为更快、更准确的检测CTLV,合成了一对特异性引物ASG-Pf和ASG-Pr,建立了运用SYBRGreenI荧光染料法检测CTLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异性、灵敏性和适用性进行了测试。结果表明,该检测体系能特异的检出CTLV,对测试的衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒和鳞皮病毒都不能检出;灵敏度比常规PCR高100倍;适用性广,可检测出多种柑橘类植物中的CTLV。实时荧光RT-PCR检测整个过程完全闭管,无需PCR后处理,且SYBR GreenI荧光染料成本较低,适用于检测柑橘体内含量较低的CTLV病毒。     

葡萄病毒A实时荧光定量RT-PCR检测技术的建立及应用

根据文献报道和GenBank已登录序列设计引物建立了葡萄病毒A（Grapevine virus A,GVA）SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量RT-PCR检测技术体系。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好线性关系,扩增效率为99.2%,决定系数为0.999,可特异性检测GVA,灵敏度高（达常规RT-PCR的100倍）,重复性好。对不同季节、不同品种以及不同部位葡萄样品（嫩叶、嫩叶柄、老叶、老叶柄、卷须和休眠枝条）中GVA的检出率普遍高于常规RT-PCR。不同季节间比较,对秋、冬季样品检测效果最好,除嫩叶外其余部位检出率均达100%,春夏季检出率为10% ~ 100%。不同部位间比较,老叶柄和休眠枝条检测效果最好,检出率均达100%,其次为老叶（80% ~ 100%）,其余部位样品检出率为10% ~ 100%。在大量田间样品检测中,休眠枝条样品检测结果与常规RT-PCR一致,而秋季老叶柄样品检出率明显高于常规RT-PCR。     

葡萄蚕豆萎蔫病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法及应用

建立了葡萄蚕豆萎蔫病毒（Grapevine fabavirus，GFabV）的实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）检测技术。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系（扩增效率103.8%，相关系数0.998），灵敏度是常规RT-PCR的1 000倍，并具有特异性。采用RT-qPCR和常规RT-PCR方法对葡萄不同发育时期及不同部位的316个样品进行检测，结果表明RT-qPCR方法对GFabV的检出率（96.8%）明显高于RT-PCR（70.8%）。RT-qPCR对休眠枝条中GFabV的检出率达100%，对其他部位样品的检出率均在92%以上，明显高于RT-PCR（42% ~ 97%）。各个发育时期样品GFabV的RT-qPCR检出率（85% ~ 95%）也普遍高于RT-PCR（70% ~ 90%）。该技术对于田间样品的检测适用范围广。     

菠萝凋萎相关病毒–2实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

菠萝凋萎相关病毒（Pineapple mealybug wilt associated virus-2,PMWaV-2）是引起的菠萝凋萎病（Mealybug wilt of pineapple,MWP）的重要病原。本研究中根据PMWaV-2外壳蛋白基因序列设计特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法能高灵敏检测出阳性样品,对阴性样品及空白对照均无荧光反应;灵敏度比普通PCR高100倍;重复性试验表明批内和批间变异系数均在1.85%以内,表明本方法是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-2定量检测方法。     

基于TaqMan MGB探针的李痘病毒分子检测

李痘病毒(Plum pox virus,PPV)是我国对外检疫性有害生物。研究根据该病毒不同分离株外壳蛋白(coatprotein,CP)基因的保守序列,设计了特异性引物与荧光探针,建立了基于TaqMan MGB分子探针的PPV实时荧光RT-PCR检测方法。方法特异性研究表明,针对PPV的2个主要流行株系M株系与D株系,均能够得到典型扩增曲线,Ct值分别为14.96和18.22;而对于马铃薯Y病毒、李属坏死环斑病毒以及桃丛簇花叶病毒等其他毒株则没有典型扩增曲线,也无Ct值。灵敏度比较发现,该方法比双抗体夹心酶联免疫检测方法的灵敏度提高1000倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对PPV的检测。     

北运蔬菜基地辣椒病毒病病原种类的分子 检测

辣椒病毒病是广东、海南两省北运蔬菜基地的主要病害,十分有必要对其病原 种类进行全面
检测,以便为病毒 病的防治提供依据。本试验运用RT-PCR 方法对这两省北运蔬菜基地的辣椒病毒病或疑
似病毒病的病株样本进行分子检测。结果表明：广东省的病毒检出株率为55.67%,最主要的病毒种类是
黄瓜花叶病毒（CMV）和辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）,另有少量的马铃薯Y 病毒（PVY）、马铃薯 X 病毒（PVX）
和番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）;海南省的病毒检出株率为44.67%,最主要的病毒种类仍然是CMV 和
PMMoV,另有少量的PVY。在田间,两省均以CMV 和PMMoV 复合侵染辣椒为主。     

马铃薯土传病原菌快速检测方法的比较分析及其应用

马铃薯土传病害日益严重，对病原菌进行快速检测是病害早期诊断、预测监控、综合防治的重要基础。本文综合比 较了普通PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR、多重PCR 和环介导等温扩增技术（LAMP）在灵敏度和特异性等方面的特点， 以及在检测马铃薯土传病害时的优缺点；总结了各病害检测报道的引物信息和检测体系的优势。同时，对各技术的应用前景 进行展望，旨在对马铃薯土传病害的快速检测方法及其发展趋势有一个全面的了解。     

北京地区南瓜病毒病病原种类鉴定

为明确北京地区南瓜病毒病种类及其主要侵染病原,2016~2017年在北京周边采集疑似感染病毒的南瓜病样84份,并根据南瓜上的6种病毒特异性引物对其进行反转录PCR(RT-PCR)检测。结果表明:共有79份南瓜病样检测显示阳性,其中黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的检出率最高,为52.38%;其次是小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)和西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV),检出率分别为44.01%、14.29%,其他病毒暂未检出。此外,16.67%的样品受2种病毒复合侵染,CMV和ZYMV复合侵染占7.14%,ZYMV和WMV复合侵染占9.52%。北京地区南瓜上优势病毒种类为CMV,且存在病毒复合侵染现象。     

Cry2Aa2 和PamPAP 双价表达载体的构建及其对辣椒的遗传转化

 为了获得既抗虫又抗病毒病，又对人体和环境安全的转基因辣椒（Capsicum annuum L．）材料，将启动子CaMV35S、终止子Nos-ter 及缺失无毒型商陆抗病毒蛋白基因PamPAP 一起插入到植物表达载体pCAMBIA1301-Cry2Aa2-PMI 的多克隆位点上，构建双价表达载体，采用农杆菌介导法将其转入辣椒中，并用PMI/甘露糖筛选体系对转化植株筛选。经PCR 扩增和Southern 杂交检测，结果表明Cry2Aa2和PamPAP 已经整合到辣椒基因组中。进一步经RT-PCR 分析，证实Cry2Aa2 和PamPAP 在T₀ 代转基因辣椒植株中共表达。经抗虫性、抗病毒病表型鉴定：T₀ 代转基因辣椒植株对黄瓜花叶病毒（CMV）和斜纹夜蛾幼虫的抗性均显著高于非转基因植株。     

萝卜病毒病小RNA 分析及资源抗性表现

病毒病是为害萝卜的主要病害之一。基于核酸检测的植物病毒病检测技术，因其检测范围广、灵敏度高、适合大批 量检测而得以广泛应用。本试验利用小RNA 高通量测序方法鉴定萝卜病毒病的种类，并调查分析了264 份萝卜核心种质资 源及育种品系对病毒病的抗性。结果表明：萝卜病毒病的主要病原为芜菁花叶病毒（TuMV）。参试的核心种质资源和品系 多数表现出较好的抗性，且不同品系姊妹系间抗性表现基本趋于一致。田间抗病性调查结果显示：抗病材料有103 份，高抗 材料有64 份，且有25 份材料达到免疫。     

生物炭添加对马铃薯根际土壤真菌多样性和产量的影响

以马铃薯品种克新1 号为试材，在土壤中分别添加10、20、40 t·hm^-2 玉米秸秆生物炭，利用ITS 高通量测序技术， 研究不同生物炭添加量对马铃薯根际土壤真菌多样性和产量的影响。结果表明：各生物炭处理均降低了土壤真菌丰度，其中 以T3 处理（添加生物炭20 t·hm^-2）丰度最低。马铃薯根际土壤真菌主要包括5 个门、25 个纲、62 个目、120 个科、201 个 属和345 个种，在门分类水平上优势真菌群落为子囊菌门，相对丰度为86.86%～95.86%。添加生物炭处理有利于提高子囊 菌门的丰度，降低担子菌门和接合菌门的丰度；在科分类水平上，添加生物炭处理提高了粪壳菌目Incertae sedis 23、小子囊 菌科、毛壳菌科、丛赤壳科的丰度，降低了子囊菌科、粪壳菌科、粪壳菌目Incertae sedis 的丰度。添加生物炭处理提高了马 铃薯单株产量、单株结薯数和商品薯率，其中T3 处理效果最显著。综合产量指标和真菌多样性分析，T3 处理最有利于马铃 薯产量提高和土壤改良。     

广西辣椒病毒病调查及病原种类初步鉴定

对广西9个市县辣椒病毒病的发生情况进行初步调查,并采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)鉴定75份辣椒疑似病毒病样本的8种常见蔬菜病毒。结果表明,桂南、桂中地区辣椒病毒病发生普遍较桂西、桂北地区的严重。共有71份辣椒样本检测呈阳性,其中辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,Chi VMV)的侵染最普遍,总检出率最高,达63.38%,为广西辣椒的优势病原种类;甜椒叶脉斑驳病毒(Pepper vein mottle virus,PVMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMo V)、辣椒环斑病毒(Chilli ring spot virus,Chi RSV)的侵染也很普遍,总检出率分别为56.34%、43.66%、35.21%和33.80%。在71份阳性样本中,有87.32%的样本受2种及2种以上病毒的复合侵染,受2种或3种病毒复合侵染的分别占32.39%和29.58%;2种病毒复合侵染类型中,以ChiVMV+CMV、PVMV+PMMo V复合侵染最普遍,均占21.74%;3种病毒复合侵染类型中,以Chi VMV+CMV+PVMV复合侵染最普遍,占23.81%。     

5- 氨基乙酰丙酸对马铃薯叶片光合特性及产量和品质的影响

以马铃薯品种荷兰806 为材料，在植株生长发育不同时期叶面喷施50 mg · L^-1 外源5- 氨基乙酰丙酸（ALA）溶液，研究ALA 对马铃薯叶片光合特性及产量和品质的影响。结果表明：ALA 可以提高马铃薯叶片叶绿素相对含量，尤其提高正午和下午叶片的光合能力，降低光合午休程度。测试分析结果表明，ALA 处理提高了马铃薯叶片PS Ⅱ和PSⅠ反应中心最大光化学效率（φP_o 和φR_o），降低PS Ⅱ反应中心最大关闭速率（M_o），维持较高的光合电子传递量子产额（φE_o）和较低的能量热耗散量子产额（φD_o），提高以吸收为基础的光合性能指数（PI_abs）和包括PSⅠ和PS Ⅱ在内的整体光合性能指数（PI_total）。ALA 处理还能上调PS Ⅱ反应中心核心蛋白D1 和D2 编码基因Psb A 和Psb D 转录水平。此外，ALA 处理显著提高马铃薯块茎产量，提高可溶性糖和VC 含量，但对淀粉含量影响不显著。可见，ALA 这种全天然的非蛋白质氨基酸类物质，在马铃薯产业上具有推广应用前景。