巴西橡胶树次生乳管分化能力早期预测的相关基因初步研究

目前通过常规的试割测产进行橡胶树产量育种的方法,周期长且效率低,亟须改进。橡胶树次生乳管分化能 力是决定橡胶产量的关键因子之一,因此,次生乳管分化能力的早期预测对缩短橡胶树产量育种周期具有重要意义。 本研究采用分子生物学技术,割胶处理不同次生乳管分化能力等级的橡胶树种质的杂交后代,对水囊皮组织中的茉莉 酸生物合成关键酶基因、茉莉酸途径关键环节基因和橡胶生物合成关键酶基因等 20 个基因的表达模式进行分析,并将 基因表达与橡胶树种质次生乳管分化能力等级进行相关性分析。结果发现：茉莉酸生物合成关键酶基因 HbAOCa 和橡 胶生物学合成关键酶基因 HbHevb7 在割胶处理后上调表达,且与橡胶树种质的次生乳管分化能力等级相关性较好。该 方法可用于区分橡胶树种质间次生乳管分化能力的差异。研究结果不仅可以夯实橡胶树种质的乳管分化能力的早期预 测方法,而且可为开发次生乳管分化能力的相关分子标记提供理论基础。     

巴西橡胶树树皮结构特征与胶乳产量的相关性

采用细胞学研究技术,以7个高产的橡胶树品种、19份低产的1981’IRRDB种质和5个高比区的橡胶树无性系为材料,分析巴西橡胶树树皮结构特征与胶乳产量的相关性。结果表明,在高产品种和低产种质间、高比区无性系间以及同一无性系的植株间,有功能次生韧皮部中的乳管列数目与有功能次生韧皮部厚度的比值都与胶乳产量显著正相关。最内层石细胞团以内的次生韧皮部中乳管列数目与次生韧皮部厚度的比值在高产品种和低产种质间以及在高比区不同无性系间与胶乳产量显著正相关,但在同一无性系的植株间与胶乳产量没有相关性。     

橡胶树COP9家族基因的克隆及表达分析

COP9信号小体（CSN）是进化上保守的蛋白复合体,在茉莉酸信号途径中起着重要的作用。橡胶树的乳管是一种特化的细胞器,是天然橡胶合成和储存的场所。现有的证据表明橡胶的生物合成可能受到茉莉酸信号途径的调控,但是对于茉莉酸信号途径调控天然橡胶的生物合成还了解的不够。本研究采用RACE技术结合RT-PCR从胶乳中克隆了8个CSN基因的全长cDNA序列,根据与拟南芥的相似性,分别命名为HbCSN1~HbCSN8。荧光定量PCR结果显示,8个CSN基因均能在树皮、不同发育时期的叶片、胶乳、雄花和雌花中表达,其中HbCSN5在胶乳中的表达量最高,其他成员在叶片中的表达量最高。而且,部分HbCSNs基因在胶乳中的表达受到割胶和茉莉酸甲酯处理的上调表达。因此,推测这些上调表达的成员可能参与胶乳的茉莉酸信号途径。     

强割对不同排胶特性的橡胶树品系胶乳生理生化参数的影响

以不同排胶特性的巴西橡胶树 PR107 和 CATAS 8-79 无性系的成龄树为材料，研究强割处理对胶乳中橡胶生 物合成相关生理参数和基因表达的影响。结果表明，强割处理的 PR107 和 CATAS 8-79 品系的胶乳中，HblMYC1 基因 表达量均呈现先上升后降低的模式，且在强割第 3~4 刀时达最大值，后期的 HblMYC1 基因表达量低于初始水平。胶乳 干胶含量的变化趋势与 HblMYC1 基因表达量的趋势一致，而排胶时间、胶乳产量和干胶产量这 3 个生理参数也呈现先 上升后降低的趋势，但在强割的第 5~6 刀时达才到最大值，后期恢复到初始水平。对强割处理胶乳中的各项生理参数 及 HblMYC1 基因表达量进行相关性分析，发现 PR107 品系的胶乳产量、干胶含量与干胶产量三者间均呈极显著正相关， 干胶含量与 HblMYC1 基因表达呈极显著正相关；CATAS 8-79 品系的排胶时间与胶乳产量呈极显著正相关，排胶时间、 胶乳产量、干胶含量三者与干胶产量呈极显著正相关。研究结果表明，在强割条件下的胶乳生理参数和 HblMYC1 基因 表达量之间存在相关性，且能够更快速反映出橡胶树品系的橡胶生物合成特性，为利用分子生物学技术指导制定适宜 的橡胶树割胶制度提供理论依据。     

橡胶树树皮中ACC氧化酶基因（HbACO7）的表达特性及功能探究

天然橡胶是重要的工业原材料,主要来自橡胶树树皮中的乳管。乙烯能促进橡胶树乳管产胶和排胶,在树皮上施用乙烯利（一种乙烯释放剂）或乙烯可显著提高胶乳产量。基于本课题组前期获得的橡胶树基因组和转录组数据,克隆橡胶树中乙烯合成通路关键酶——1-氨基环丙烷基-1-羧酸（ACC）氧化酶基因家族（HbACOs）的全部8个家族基因,研究其组织表达模式。结果表明：在分析的7种组织中,尽管HbACO基因存在不同程度的冗余表达,但每种基因的组织表达模式具有明显的特异性,其中HbACO7是树皮中表达量最高的家族基因。HbACO7基因的表达在割胶季节的不同月份发生明显变化,其中在8月的表达量最高。成功构建了HbACO7基因的原核表达载体,实现其在大肠杆菌BL21中的诱导表达。纯化后的HbACO7重组蛋白具有明显的ACO酶催化活性,成功地催化了乙烯的体外合成。该结果将为后续橡胶树树皮中的乙烯生物合成调控机制研究提供参考。     

橡胶树HbREF3基因的克隆及功能初步分析

橡胶延伸因子（REFs）是橡胶粒子上的一种主要膜蛋白,在橡胶生物合成途径中具有延伸橡胶烃和稳定橡胶粒子等重要作用。对橡胶树不同组织的转录组测序发现,HbREF3在胶乳中具有特异性的高表达,且其在HbREFs基因家族中表达水平也相对较高,仅次于表达丰度最高的HbREF1。HbREF3的开放阅读框为528 bp,编码175个氨基酸,对应的蛋白相对分子质量为19.62 kDa,理论等电点（pI）为5.28。系统进化树分析表明,HbREF3与橡胶树其他HbREFs虽均属于分组Ⅰ,但与HbREF1明显属于不同分支。HbREFs均含有REF保守结构域,但在保守motif的分布上,不同HbREFs蛋白含有保守motif数量不等,HbREF3比HbREF1多了一个motif。生信预测分析表明,该蛋白属于亲水性蛋白,无跨膜结构域,具有14个磷酸化位点。亚细胞定位分析发现HbREF3蛋白定位在内质网上,推测其可能参与橡胶粒子的形成和胶乳的再生。本研究结果为进一步阐明HbREF3基因在橡胶树胶乳再生中的作用机制奠定了基础。     

巴西橡胶树胶乳表达ABC转运蛋白HbGCN1的克隆与表达研究

橡胶生物合成是一种典型的植物类异戊二烯次生代谢,它是影响橡胶产量的首要因素。ABC转运蛋白(ATP Binding Cassette transporter,ABC transporter)是一类与植物次生代谢密切相关的蛋白大家族。筛选已构建的茉莉酸诱导橡胶树胶乳消减文库,并克隆了1个GCN(general control non-repressible)亚族ABC转运蛋白基因EST,通过RACE技术获得其全长cDNA序列,命名为HbGCN1。该基因开放阅读框共1 815 bp,编码605个氨基酸残基。表达分析表明:HbGCN1主要在橡胶树树皮及胶乳中表达,且在乙烯、茉莉酸或伤害诱导下上调表达,推测其可能与橡胶生物合成相关。原核表达该基因,为进一步的研究奠定基础。     

利用oligo芯片技术鉴定橡胶树死皮相关基因

橡胶树死皮（Tapping Panel Dryness,TPD）是天然橡胶单产提高的主要限制因子之一,给橡胶种植业带来严重危害。本研究利用定制橡胶树oligo芯片,通过提取死皮和健康橡胶树胶乳总RNA,标记并反转录成cDNA后与橡胶树oligo芯片进行杂交鉴定TPD相关基因,利用RT-PCR技术对芯片结果进行验证。对芯片数据分析结果显示,以2倍标准在死皮与健康橡胶树间筛选到26个差异表达基因,其功能涉及橡胶生物合成、细胞程序性死亡、细胞抗性及防御反应、活性氧代谢、DNA甲基化、泛素-蛋白酶体、信号传导、蛋白质合成、加工及转运等调控途径。进一步的RT-PCR验证结果表明,随机选取12个基因的表达模式均与芯片结果一致。本研究为大规模鉴定TPD相关基因和揭示TPD发生分子机制奠定了基础。     

橡胶树野生种质抗寒前哨苗圃系比区寒害调查报告

2011年4月对广东新华农场抗寒前哨点的120份1981’IRRDB野生橡胶种质寒害调查结果：参试种质中有42份种质寒害级别低于对照,表现出较强的对低温的忍耐力,说明参试野生种质群体中存在大量的耐寒基因,其中大多来至Rodonia地区野生种质,可作为橡胶树抗寒种质选择的优质、高效群体。     

橡胶树1981’IRRDB野生种质预割诱导次生乳管分化的比较分析

巴西橡胶树树干树皮中的次生乳管是天然橡胶合成和贮存的主要组织,次生乳管列的多少与胶乳产量密切正相关。割胶是天然橡胶生产中的核心环节,是当前获得天然橡胶的唯一途径,而割胶伤害能诱导次生乳管分化。采用碘-溴染色方法和石蜡切片技术,观察预割前后1981’IRRDB野生种质成龄树的树皮结构,对不同种质预割前后黄皮层和水囊皮区域的乳管列进行统计,并分析新分化的次生乳管列。研究结果表明,选取的85份8年生野生种质在自然条件下的乳管分化能力普遍较弱,黄皮层和水囊皮中成列的次生乳管数量均较少,2个部位合计乳管列数普遍低于8列。预割后不同种质水囊皮中次生乳管列数普遍增多,但黄皮层尚无明显变化。根据伤害诱导分化新的次生乳管列数的多少,将预割诱导乳管分化的能力由低到高分为1、2、3级,分别对应于新分化乳管列数为少于2列、2~3列(含2列)、3~4列（含3列）。在85份种质中,对应1级57份、2级23份、3级5份的种质,所占比例分别为67.06%、27.06%、5.88%,可见,诱导分化次生乳管能力强的种质占比较低,大部分种质为1、2级乳管分化,3级分化能力的种质极少。被诱导新分化次生乳管的能力与种质在自然条件下的分化能力有关,尤其是高乳管分化能力的种质通常在自然条件下也有较强的分化乳管的能力。通过预割判断乳管分化能力不仅为野生种质鉴定和评价奠定基础,也为橡胶树高产育种以及早熟、晚熟品种的早期预测提供有效指标。     

铝胁迫下橡胶苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选

铝毒是热带地区酸性土壤上抑制作物生长的主要因素,但目前关于铝活化后对橡胶树生长和产胶的影响及橡胶树耐铝机制的研究很少。为了筛选出橡胶树在铝毒胁迫下稳定表达的内参基因用于实时荧光定量PCR分析,本研究选择了Actin、Actin7、18S rRNA、40S rRNA、YLS8、UBC2、UBC4、GAPDH、FP和ADF等10种常见的基因作为候选内参基因,通过qRT-PCR检测,利用内参基因评价软件geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct算法以及综合评价软件RefFinder对10个候选内参基因的表达稳定性进行评估。综合评价结果表明,铝胁迫后表达稳定性排名前3的内参基因依次分别为UBC4、40S rRNA和FP。进一步选取UBC4、40S rRNA、FP基因和UBC4+40S rRNA+FP基因组合以及稳定性较差的GAPDH基因作为内参基因对橡胶树铝诱导苹果酸分泌转运蛋白基因HbALMT-1和HbALMT-2进行相对表达分析,结果显示2个目的基因相对于3个内参基因及其组合均显示出一致的表达水平,而稳定性较差的内参基因GAPDH未能准确地对目的基因的表达量进行校正。综上所述,筛选出UBC4、40S rRNA和FP基因以及UBC4+40S rRNA+FP基因组合可作为铝毒胁迫不同天数下表达最稳定的内参基因,可用于铝毒胁迫下橡胶树相关基因的表达分析。     

橡胶树F3’H基因克隆及其功能分析

从橡胶树叶片转录组数据库中调取花青素合成途径中的关键酶类黄酮3’-羟化酶（F3’H）基因序列信息,通过RT-PCR扩增得到2个橡胶树F3’H基因,分别命名为HbF3’H1和HbF3’H2。通过荧光定量PCR分析发现,只有HbF3’H1基因在不同发育时期的橡胶树叶片和嫩茎中的表达水平与花青素的合成积累趋势完全一致。HbF3’H1所编码的蛋白属于P450超家族,具有保守的F3’H结构域,而且HbF3’H1基因的启动子中包含多种环境效应元件,说明HbF3’H1基因的表达受环境因子调控。通过农杆菌转化烟草发现,过表达HbF3’H1基因的烟草花瓣大量累积花青素,其颜色较非转基因烟草显著加深,同时,荧光定量PCR发现HbF3’H1表达水平与转基因烟草花瓣颜色呈正相关,说明HbF3’H1基因表达促进花青素的累积。本研究为阐明橡胶树花青素代谢途径奠定基础。     

橡胶树树皮miRNA定量表达分析的内参筛选

世界所需天然橡胶主要来自橡胶树，橡胶树的乳管是合成和储存天然橡胶的组织，树干树皮中的次生乳管与天然橡胶生产密切相关，由维管形成层分化而来。次生乳管数量与天然橡胶产量呈显著正相关。因此，乳管分化是天然橡胶生产面临的一个重大理论课题。植物miRNAs是一类长约20~24个核苷酸的非编码小RNA分子，通过介导基因沉默在植物生长发育、细胞分化及逆境适应中起着非常重要的调节作用。橡胶树乳管分化过程中差异miRNAs的鉴定对于进一步认识乳管分化的分子机理具有重要的作用。实时荧光定量PCR（qPCR）已广泛用于miRNA的定量表达分析，选择合适的miRNA内参对于准确进行miRNA的表达定量至关重要。本研究以冠菌素（coronatine, COR）诱导橡胶树萌条分化次生乳管的实验系统，采用小RNA Poly A加尾的qPCR技术分析COR处理对形成层区3个非编码RNA（U6 snRNA、5S rRNA、18S rRNA）和6个miRNA（hbr-miR159b、hbr-miR396b、miR169-x、miR172-y、miR535-x、miR894-x）候选内参的表达稳定性的影响。geNorm和NormFinder软件的联合分析结果显示，表达稳定性最高的是hbr-miR396b和miR894-x，稳定性较差的是U6 snRNA。hbr-miR396b和miR894-x可作为合适的内参基因，用于分析COR影响下的miRNA相对定量表达，为鉴定橡胶树次生乳管分化相关的差异表达miRNAs奠定良好基础。     

橡胶树1981''''IRRDB种质主要性状鉴定评价——1987年定植种质鉴定评价研究报告

对我国1987年定植保存于大田的81份1981’IRRDB种质进行了茎围、产胶量、乳管数目鉴定和抗风性调查。结果表明,种质间差异非常明显,其中62号种质的茎围和产胶量相对较高,风害较轻,可以作为育种材料纳入橡胶树育种进程中,以拓宽现有橡胶树品种的遗传基础。对81份种质茎围、产胶量及乳管数目间的相关性分析结果表明,茎围与产胶量间相关达到显著(r=0.263*),产胶量与乳管列数和个数间相关达到极显著(r=0.631**,r=0.422**)。     

橡胶树无性系产胶能力株间一致性分析

橡胶树无性系株间产量存在明显差异是导致产量育种选择周期长的主要原因之一。橡胶树的产量主要取决于产胶能力和排胶能力2个因素。树干树皮中的次生乳管数量及乳管细胞内的天然橡胶生物合成效率与产胶能力直接相关。从次生乳管分化和橡胶合成关键因子基因表达2个层面对无性系株间产胶能力的一致性进行分析。结果表明:树皮最内石细胞群以内次生乳管列数与次生韧皮部厚度的比值具有品系特征;在同一品系中,该比值的株间差异小,表现出良好的一致性。8 a割龄大树该比值的株间一致性较3 a幼树差,而在3 a幼树中,树高40 cm处该比值的株间一致性比树高100 cm处更好。因此,以3 a幼树树高40 cm处的该比值作为产量育种早期筛选标记较合适。胶乳中MYC1、HRT2基因的表达量在割胶后上调,并且具有品系特征,但这2个基因的表达量在株间的一致性较差,故在产量育种早期筛选中只能起到辅助作用。     

季节、采胶和外源茉莉酸对成龄橡胶树乳管分化的影响

橡胶树树干树皮中的乳管列数目与橡胶产量密切相关。为了建立成龄橡胶树乳管分化的调控技术,笔者采用实验形态学的手段,研究季节、采胶和外源茉莉酸对成龄橡胶树乳管分化的影响。结果表明,在海南岛自然条件下,乳管分化开始于6~7月份,在11月~翌年的5月没有乳管分化;割胶包括正式割胶前的预割能显著提高橡胶树形成层分化乳管的能力,其影响的范围相当大;外施茉莉酸对未开割树和割胶树的乳管分化都有促进作用。这些知识对于发展高效合理的采胶技术可能具有指导意义。     

可可FAT基因家族进化及表达模式分析

在植物中,酰基-ACP硫酯酶（fatty acyl-ACP thioesterase, FAT）是调控脂肪酸合成的关键酶。为解析可可FAT基因家族成员的特点与功能,本研究从可可基因组中筛选鉴定出FAT基因家族的6个成员,分别命名为TcFATA、TcFATB1、TcFATB2、TcFATB3、TcFATB4、TcFATB5。6个基因外显子数目为6~7个,编码区（CDS）长度介于1128~1263 bp,预测蛋白分子量介于42.72~46.47 kDa,等电点介于6.57~9.10。进化分析结果表明可可FAT基因家族分成FATA与FATB亚群,FATA亚群包含1个可可TcFATA成员,FATB亚群包含5个可可TcFATBs成员。不同可可种子发育时期表达分析结果表明:TcFATA和TcFATB1伴随果实发育成熟,表达量呈下降趋势,TcFATA和TcFATB1在不同种质中表达量与油酸（C18:1）和棕榈酸（C16:0）比例呈正相关,表明其与脂肪酸组分比例调控有紧密关联。