甘蓝型油菜A7-FT启动子的功能分析

为了利用PCR技术得到甘蓝型油菜A7-FT基因启动子序列,根据甘蓝型油菜全基因组序列,利用启动子在线预测软件预测其功能与结构,根据其预测的顺式元件的分布,从5′端开始缺失的方式获得5个不同片段长度的启动子序列。构建含不同片段长度启动子的GUS基因表达载体,利用农杆菌介导拟南芥,得到T_2幼苗,经过GUS染色与脱色,探讨A7-FT基因启动子的功能,为研究甘蓝型油菜开花调控机制提供理论基础。通过PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因DNA中获得A7-FT基因启动子序列。利用PLACE和PlantCARE在线工具对该段序列进行预测,发现A7-FT基因启动子除了存在启动子核心元件CAATbox和TATAbox,还有光应答元件、激素应答元件、胚乳表达应答元件、抗逆性应答元件、生理控制相关的顺式作用元件。基于预测的顺式作用元件的分布情况,设计特异性引物,克隆不同片段长度启动子,与pCAMBIA1303载体构建5′端缺失载体,分别命名为M1、M2、M3、M4、M5。通过农杆菌介导拟南芥,GUS染色与脱色结果显示,在-1 549～-238可能存在一些负调控元件的结合位点,而-238～+1区域是该启动子的核心区段。     

大豆GmWRI1a基因启动子克隆及序列分析

以大豆基因组文库Phytozome公布的大豆Williams82基因组序列为参考,应用Primer Premier 5.0软件设计引物,用PCR技术扩增了大豆GmWRI1a基因的启动子序列,构建了重组克隆载体pGM-TpGmWRI1a,并通过PCR扩增对阳性克隆进行鉴定送测序。克隆获得GmWRI1a基因启动子序列1 686bp,该启动子序列除含有必需的起始转录位点、TATA-box、CTTA-box外还包含多个顺式作用元件,如光应答元件、赤霉素应答元件、表达分生组织相关元件、抗旱诱导元件等。同时,构建了该启动子植物表达载体pBI-pGmWRI1a,通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定,为启动子的功能研究奠定基础。大豆GmWRI1a基因启动子克隆与序列分析,将为进一步研究大豆GmWRI1a基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

拟南芥rd29A基因启动子克隆及其在马铃薯抗胁迫转基因中的应用

从拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组中用PCR技术分离了rd29A基因上游824 bp的调控序列,序列分析表明该片段与已报道的rd29A启动子有99.39%的同源性,包括缺水诱导表达元件DRE、ABA作用元件ABRE等顺式作用元件。将此片段与GUS基因连接构建了植物表达载体pBIrd,用农杆菌介导法获得了转基因马铃薯植株。对转基因植株进行G     

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14启动子克隆与功能分析

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14受低磷诱导表达,其超表达显著提高植物有机磷利用效率,为进一步探究其调控机制,本研究以GmPAP14cDNA序列检索大豆参考基因组,获取基因上游启动子序列,设计引物克隆了中黄15 GmPAP14启动子序列。利用PLACE与PlantCARE预测启动子调控元件发现,该序列中含有增强子调控元件、组织特异表达元件,根特异表达元件、转录因子PHR1结合的PIBS元件等。构建了GmPAP14启动子3个5’端缺失片段融合GUS的植物表达载体PGmPAP14-2568-GUS、PGmPAP14-2238-GUS、PGmPAP14-1635-GUS,并通过Floraldip法获得转基因拟南芥。利用GUS染色和活性测定分析GmPAP14启动子不同片段表达活性发现,正常磷条件下各片段转基因拟南芥均在根尖表达,低磷条件下GUS染色可扩展到成熟区和根毛,另外转PGmPAP14-2238-GUS植株的GUS活性最高。这些结果为后续的基因调控研究奠定重要基础。     

拟南芥RBCS-1A基因受光调节表达模式及其启动子遗传转化应用评价

RBCS编码光合碳同化关键酶核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的小亚基, 是控制植物光合作用的重要基因之一。本研究利用实时荧光定量PCR技术分析拟南芥RBCS-1A受光调节表达模式, 结果表明, AtRBCS-1A表达受光诱导, 同时具有组织表达特异性; 运用生物信息学手段分析发现, 该基因启动子序列中存在多个参与光应答的顺式作用元件; 采用PCR技术从拟南芥基因组中分离到长度为1 691 bp的AtRBCS-1A启动子片段, 将该片段与GUS报告基因融合构建植物表达载体并转化野生型拟南芥, 对获得的转基因植株进行GUS染色, 结果显示, AtRBCS-1A启动子是光诱导型和组织特异型启动子。以上结果初步证明, AtRBCS-1A启动子应用于植物遗传转化切实可行, 具有重要应用价值。     

大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子的克隆及其表达活性分析

以吉豆2号基因组为模板,通过TAIL PCR方法,扩增得到大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子片段SACPD-Cp。PLACE在线启动子预测分析表明, 该序列中含有多种典型的种子特异性表达序列元件。将SACPD-Cp片段取代pCAMBIA1301质粒中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SACPD-Cp,通过农杆菌介导法在大豆组织中进行瞬时表达,GUS组织化学染色和荧光定量研究其表达特性。结果表明, SACPD-Cp驱动GUS基因在种子中的表达活性是CaMV35S启动子的93.01%;SACPD-Cp启动子与现已知启动子无同源性,仅在大豆种子中检测到GUS活性,而在根、茎和叶组织中均未检测到GUS活性,证实 SACPD-Cp是一个新的种子特异性启动子。     

核盘菌分枝酸变位酶同源效应蛋白启动子的克隆及功能分析

为了进一步研究分枝酸变位酶同源效应蛋白在核盘菌与植物互作过程中的作用机制,对其启动子进行了克隆和功能分析。采用启动子在线软件Promoter 2. 0和Promoter scan分析分枝酸变位酶同源基因的上游序列,寻找其启动子位点和顺式作用元件,然后通过PCR技术克隆预测启动子的DNA序列,构建荧光蛋白GFP融合载体,转化核盘菌,最后通过检测GFP荧光信号来验证启动子功能。经生物信息学分析发现,该效应蛋白基因上游具有启动子序列特征,包含TATA盒和CAAT盒等顺式元件,采用引物XS1-1和XS1-2进行PCR扩增,得到了733 bp启动子序列,序列包含相关的启动元件,然后以质粒pBlunt NAT-GFP为基础,将经PCR克隆得到的启动子(N-Pro)片段连入载体中,构建得到启动子N-Pro+GFP融合载体,通过REMI技术转化核盘菌原生质体,潮霉素筛选得到了一些转化子,PCR验证融合载体整合到了核盘菌基因组DNA上,最后经荧光显微镜检测到了菌丝GFP荧光信号,结果表明,克隆的分枝酸变位酶同源基因ATG上游733 bp的DNA序列具有启动子功能。     

巴西橡胶HbWRKY55启动子的克隆及功能初步分析

为深入研究巴西橡胶树HbWRKY55调控天然橡胶生物合成机制,本研究根据已克隆的巴西橡胶树HbWRKY55的序列和橡胶树基因组序列信息设计引物,通过PCR技术获得了HbWRKY55起始密码子ATG上游1 587 bp的序列,利用Plant CARE数据库对该序列的调控元件进行分析。分析结果表明该启动子序列除具有多个典型的真核生物启动子基本元件如增强子元件CAAT-box、启动子核心序列TATA-box等外,还存在赤霉素反应元件GARE-motif、P-box以及水杨酸响应元件TCA-element等参与激素调控的应答元件,同时光应答元件BoxⅠ、Gap-box、Ⅰ-box、L-box、GAG-motif和GT1-motif,胚乳表达的调控元件GCN4-motif、Skn-1_motif和厌氧诱导元件ARE等顺式作用元件也包含其中。构建了该序列的4个5'端缺失片段和荧光素酶基因融合的表达载体,瞬时表达结果表明赤霉素(GA)、水杨酸(SA)可以抑制HbWRKY55启动子的活性,脱落酸(ABA)、茉莉酸甲脂(MeJA)可以加强HbWRKY55启动子的活性。在HbWRKY55启动子的-641~-455和-237~+1可能存在抑制ABA的元件;HbWRKY55启动子的-454~-238和-66~+1存在JA应答增强元件。本研究为深入了解HbWRKY55的调控机理提供帮助。     

水稻 Glu B-1启动子克隆及序列分析

GluB_1是水稻种子谷蛋白的编码基因,是种子成熟过程中,由GluB_1启动子调控,特异地在胚乳中表达的蛋白。以水稻基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到Glu B_1启动子片段,将其克隆在pGEM_T Easy载体上进行序列分析。结果表明:获得的启动子片段的大小为2 293 bp,与已报道的该启动子序列相比较,其核苷酸序列同源性为99.2%。该启动子区域含有ACGT基序、AACA基序和GCN4基序等胚乳特异表达必需元件。     

GmCYP78A5基因启动子的克隆及表达分析

利用PCR技术从大豆(Glycine max L.Merrill)中分离了细胞色素P450基因(cytochrome P450,CYP-78A5)的启动子,序列分析结果表明,扩增片段大小为1 650 bp,与已报道序列的相应区域同源性达99.21%。RT-PCR结果表明,CYP78A5基因在大豆不同组织中的表达存在差异,在未成熟种子中表达水平较高,在茎(上胚轴与下胚轴)中有微弱表达,而在根、叶、花组织中不表达。将该启动子片段与GUS报告基因融合在一起,构建了植物表达载体,并用农杆菌介导法导入了烟草(Nicotiana tabacum)中。对转基因烟草植株中的GUS表达分析表明,Gm CYP78A5启动子可驱动GUS报告基因在转基因烟草的幼苗根上部组织、花器官的花萼和花柄组织及种子中高效表达,而在其他部位均未检测GUS活性。     

35S启动子甲基化引起棉花转基因沉默

 用带PBI121质粒的农杆菌LBA4404菌株转化泗棉3号胚性愈伤组织,获得的再生植株进一步对gus和nptⅡ基因进行PCR跟踪检测,共得到97株阳性转基因植株。GUS组织化学检测发现,97株转基因幼苗中有10株GUS检测阴性,嫁接后,只成活一株。利用来源于同一愈伤系的GUS检测阳性植株作为对照,对这一GUS检测阴性的植株进行gus基因沉默机理研究。Southern分析表明,该GUS检测阴性植株与GUS检测阳性植株有相同拷贝数。GUS组织化学检测和RT-PCR分析显示,gus基因在GUS检测阴性植株中没有表达,而nptⅡ基因在这两株转基因棉花中都表达。用限制性内切酶-PCR法分析35S启动子区甲基化发现：GUS检测阴性植株35S启动子区TATA box的HapII/MspI酶切位点发生甲基化,而GUS检测阳性植株该位点没有甲基化。以上研究表明,这株gus沉默的转基因棉花可能是由于其35S启动子区甲基化引起的。     

转基因可食疫苗研究策略与研究进展

利用植物生物反应器规模化生产的转基因可食疫苗成本低廉,免疫方便,应用前景广阔。随着鸡新城疫转基因可食疫苗的批准上市,转基因可食疫苗必将掀起新一轮的研究热潮。本文对转基因可食疫苗的研究策略、研究现状、存在问题作一综述。     

遗传转化的黑曲霉植酸酶基因(phyA2)对玉米利用土壤有机磷能力的影响

以转黑曲霉植酸酶基因(phyA2)玉米T9代纯合系及与之对应世代的阴性对照为材料,通过低磷土壤培养试验研究植酸酶基因(phyA2)对玉米利用土壤有机磷能力的影响。结果显示,在施用植酸钠和不施磷的条件下,与阴性对照相比,转基因玉米根际土壤的磷酸酶活性分别提高5.17%和5.48%,根际中等活性有机磷分别降低16.2%和28.2%;植株磷积累量分别增加140%和100%,各生长指标都明显好于阴性对照。说明遗传转化的黑曲霉植酸酶基因能提高玉米利用土壤有机磷的能力,增加玉米体内磷的积累,改善玉米的生长状况。     

Analysis on Gene Flow and Survival Competitiveness of Transferred Disease Resistance Gene Cotton and Siblings Plant(Hibiscus trionum L. and Abutilon theophrasti Medic.)

The possibility of genetic drift between disease-resistant transgenic cotton, containing the chitinase and tobacco glucanase gene (pBLGC) , and siblings plant (Hibiscus trionum L. and Abutilon theophrasti Medic), was analyzed using the hybridization and DNA introgression in north of Xinjiang. And the survival competition ability of transgenic cotton and field weed was assessed through the monitor of plant height, community species and population density, biological diversity, and biomass in the cotton seedling stage, budding period, flower fluid phase, and wadding stage in the situation of bare land planting. The results revealed that distant hybridizations between disease-resistant transgenic cotton and sibling plant (Hibiscus trionum L. and Abutilon theophrasti Medic.) could not fruit, and the possibility of the target genes of disease-resistant transgenic cotton being transferred to weeds by DNA introgression is very small. Futhermore, transgenic cotton did not enhance their competitive ability with weeds populations for plant height and population density index in natural field condition with normal irrigation and bare land planting. This suggests that the possibility of the disease-resistant transgenic cotton converting into weeds is almost zero.     

过表达和抑制表达2-Cys Prx基因烟草的生长、生理特性和叶片光合功能对模拟酸雨的响应

为揭示2-Cys Peroxiredoxins(2-Cys Prx)基因在烟草龙江911抗逆中的功能,以过表达2-Cys Prx基因烟草、抑制表达2-Cys Prx基因烟草和非转基因烟草幼苗为试材,研究了不同pH值的模拟酸雨对其生长指标、叶片生理生化特性和叶片光合生理的影响。结果表明:与对照相比,pH值4.0的模拟酸雨对3种基因型烟草的株高、叶面积、比叶重无明显影响,pH值2.5的模拟酸雨处理下,与对照相比,过表达2-Cys Prx基因烟草幼苗的株高无明显变化,抑制表达2-Cys Prx基因烟草和非转基因烟草幼苗的株高显著降低;随着模拟酸雨pH值降低,3种基因型烟草叶片的硝酸还原酶(NR)活性、可溶性蛋白含量、SOD和APX活性、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、实际光化学效率(ФPSⅡ)、光化学猝灭系数(qP)、光系统Ⅱ潜在光化学效率(Fv/Fo)和细胞膜稳定指数逐渐下降,非光化学猝灭系数(qN)和H_2O_2含量逐渐增加,但在相同pH值的模拟酸雨处理下,过表达2-Cys Prx基因烟草各项生理指标均优于抑制表达2-Cys Prx基因烟草和非转基因烟草幼苗。由此可知,增强2-Cys Prx基因在烟草中的表达可能提高烟草在模拟酸雨处理下的硝态氮利用能力,并在模拟酸雨处理造成APX活性下降时,清除叶绿体中的H_2O_2,使光合电子传递链保持稳定,增强烟草叶片的光合能力。     

转C4光合基因水稻及其在育种中的应用

按光合作用途径可将植物分为C3植物、C4植物和CAM植物,由于C4植物在高光强、高温和高氧分压的条件下,比C3植物具有较高的光合效率,作物生理和育种学家就试图用C4光合途径改造C3作物,以提高主要农作物如稻、麦和大豆等光合生产力,但通过常规杂交的方法难以奏效。近年来,随着分子生物学的兴起和植物转基因技术的快速发展,许多与C4光合作用途径相关的关键酶PEPC、NADP-苹果酸(NADP—ME)和PPDK等一系列基因已从玉米、高粱和苋菜等C4植物中被克隆,对这些基因启动子序列分离、重组、转化及表达的研究,发现它们可以在C3植物中驱动外源基因并进行组织特异性表达,而且一系列C4型光合基因导入C3植物的成功报道。特别是获得高表达的转C4光合基因水稻,表现光合能力和种子产量显著提高,而且在光逆境的条件下,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的活性提高,从而有效地清除活性氧分子,表现耐光抑制(氧化)等。目前利用转C4光合基因水稻的育种研究也取得了重要进展,培育出携带C4光合基因的高光效水稻株系,在遗传上证明了常规育种和生物技术结合可以将转C4光合基因水稻中高表达的C4光合基因遗传给后代,获得高光效的超级稻,最后提出了本研究中尚需深入研究的问题。     

过表达谷子液泡H~+-ATPase E亚基基因在拟南芥中的耐盐性

V-H+-ATPase在植物生长、发育和胁迫响应等生物学过程中发挥重要作用。本研究通过序列比对,从谷子中克隆到V-H+-ATPase E亚基基因Si VHA-E。进化树分析显示,Si VHA-E基因在进化上属于E1/E3亚族,与玉米V-H+-ATPase E亚基基因Zm VHA-EL亲缘关系较近。表达谱分析结果显示,Si VHA-E在高盐、茉莉酸甲酯(Me JA)、水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)处理下表达上调,在低温和低氮处理下表达下调。亚细胞定位分析表明Si VHA-E定位于液泡膜上。遗传转化拟南芥的耐盐性鉴定表明,在盐处理条件下,转基因株系的种子萌发率、幼苗主根长、植株鲜重及存活率显著高于野生型的。与野生型拟南芥植株相比,Si VHA-E过表达植株体内Na+含量减少,体内相对含水量提高。此外,ABA萌发试验结果显示,在种子萌发后期,Si VHA-E过表达植株对ABA更加敏感。研究表明,谷子Si VHA-E可以显著提高拟南芥耐盐性,这可能与其正向调控ABA信号途径以及减少植株体内Na+积累和水分散失有关。     

优化的VHb基因和GFMcryIA基因构建的双价基因在烟草中的表达

利用人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白（VHb）基因与人工合成的GFMcryIA基因构建成双价基因植物高效表达载体。通过根癌农杆菌介导转化烟草，获得了36株卡那霉素抗性植株。经转基因植株的PCR及Southern blot检测，证实了双价基因在35株烟草基因组中的整合。Western blot检测证实了VHb基因的表达，杀虫实验证实GFMcryIA基因也表达出活性毒蛋白。且转基因烟草平均每株干重比非转基因烟草植株高7％。本研究结果表明转基因育种技术在培育出既高产又具抗虫性的作物或经济作物新品种方面具有良好的应用前景。     

转枯草芽孢杆菌纤溶酶基因对烟草激素代谢的影响

010018 内蒙古呼和浩特市内蒙古农业大学西区1449信箱     

转棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因烟草的获得及其功能的初步验证

构建了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入NC89烟草,PCR、Southern blotting检测结果显示有4个烟草株系中整合了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因,SOD酶活性测定结果显示4株转基因烟草植株SOD酶活性都明显高于非转基因烟草,离体叶片暗处理试验结果也证明四株转基因烟草比非转基因烟草SOD酶活下降速度明显减慢,百草枯喷施试验表明,转基因烟草都比非转基因烟草对百草枯的耐性增强,这一系列试验间接地说明外源基因的导入增强了烟草的耐衰老能力,本研究为今后利用SOD基因研究作物的早衰性状奠定了基础.