63份柚类资源S基因型鉴定

以‘晚白柚’等63份柚类资源为材料基础,通过RNA-seq和序列特征分析发掘新的S-RNase,并结合前期已有的9个S-RNase基因信息,设计21对特异性引物,扩增鉴定63份柚类资源的S基因型。结果发掘到12个新的S-RNase,按顺序分别命名为S₁₀-RNase～S₂₁-RNase。特异扩增结果显示：鉴定的63份材料中,有59份材料得到完整的S基因型,4份仅鉴定到1个S-RNase基因,其中S₂-RNase扩增频率最高,达34.92%(22/63),S₄-RNase和S₆-RNase在63份材料中均未扩增出。结果还显示许多品种具有相同的S基因型。     

桃自交亲和性的分子机制及遗传特性研究

 以油桃（Prunus persicavar.necturina）‘中油5号’及其自交后代为试材,利用花柱S-RNase基因和花粉SFB基因的特异性引物进行PCR扩增,对扩增片段进行回收、克隆、测序和Blast分析,确定了‘中油5号’的自交不亲和基因型为S₁S_2(m)。序列分析结果显示,‘中油5号’桃S₁-RNase和S_2(m)-RNase与多个其他李属S-RNase基因氨基酸和核苷酸序列间都具有极高的相似性,SFB₁和SFB₂基因与多个其他李属SFB基因氨基酸和核苷酸序列间也都具有极高的相似性。进一步对‘中油5号’自交后代个体的S基因型进行检测,发现后代群体中存在3种S基因型,分别为S₁S₁、S₁S_2(m)和S_2(m)S_2(m),且分离比为8︰13︰7,与预期的比例1︰2︰1差异不显著（χ² = 0.214 < χ²_0.05,2 = 5.991）,说明S-RNase基因和SFB基因都遵循两因素的孟德尔遗传规律进行连锁分离。此外,基因型为S₁S₁和S_2(m)S_2(m)的纯合体的存在,表明桃花粉SFB₁和SFB₂基因均不能被自身花柱S-RNase所识别,这是由于SFB₁和SFB₂基因翻译提前终止所造成的,从而使‘中油5号’表现出自交亲和性。     

新疆野生樱桃李S-RNase基因分离与鉴定的初步研究

 从4对已报道的李属树种S-RNase基因引物组合中筛选出扩增效果较好的PruC2和PruC4R组合，首次对新疆野生樱桃李（Prunus cerasifera Ehrh.）的45个株系的基因组DNA进行S-RNase基因特异性PCR扩增，并对其PCR产物进行克隆测序。这些核酸序列及其相应的氨基酸序列在GenBank中进行比对, 皆与李属的S-RNase基因有最大同源性，为新疆野生樱桃李的4种S-RNase基因，分别命名为S₁ （511 bp），S₂ （787 bp），S₃ （1859 bp）和S₄ （464 bp），在GenBank的登录号分别为EF638726、EF641276、EF661873和EF661874。45个株系中，43个株系的S基因型分别为S₁S₂、S₁S₃、S₂S₃、S₂S₄和S₃S₄，而10号和15号株系分别只鉴定了一种S-RNase基因，其S基因型组成有待于进一步研究。     

11个延边地区栽培梨品种的S基因型鉴定

鉴定梨品种的S基因型可为合理配置授粉树、杂交亲本选配提供理论依据。为鉴定11个延边地区栽培梨品种的S基因型,利用梨的自交不亲和基因（S-RNase）特异引物FTQQYQ和anti-IIWPNV,对11个梨品种的基因组DNA进行S基因特异扩增,并对扩增片段进行回收、克隆、测序,使用生物信息学软件对各序列进行分析和同源性搜...     

白梨新S基因的克隆

 采用PCR - RFLP检测、DNA序列分析和田间杂交试验, 从白梨中分离鉴定了1个新的S-RNase基因。该S-RNase基因PCR扩增产物大小与S-RNase基因PCR产物相似, 为450 bp左右。但PCR -RFLP和DNA序列分析均表明, 它与S₈-RNase基因存在较大差异, 该基因内含子为252 bp, 而S₈-RNase的内含子为234 bp, 并在高变区中具有10个氨基酸出现替换, 有两个氨基酸出现缺失。而该S-RNase基因却与S₁₂-RNase基因具有较高的相似性, 在HV区中只有1处碱基被替换, 周边区中有10处出现碱基替换或缺失。因此, 继梨S18-RNase基因, 将它命名为S₁₉-RNase基因(AY250987) 。与S 基因型已确定的梨品种的杂交坐果率也说明了该基因是一个新的S-RNase基因。     

梨20个品种S基因型的鉴定及新S-RNases基因克隆

 为了鉴定我国梨品种和一些野生类型个体的S基因型,应用S-RNase特异PCR扩增、克隆和测序,对其S-RNases基因核苷酸序列进行分析,鉴定了20个梨品种和野生类型个体的S基因型。起源于我国的'奥连'(S_pS₃₂)、'吊蛋'(S_dS_e)、'沙疙瘩'（S₃₆S_d）品种和杏叶梨的一个类型（S₂₂S_c）个体中存在西洋梨的S-RNase基因,证明S-RNase基因分化是在东方梨种群和西方梨种群的各个种形成之前。在秋子梨的'麦梨'、'内蒙古山梨'中发现了2个新S-RNases基因,命名为S₄₀-、S₄₁-RNase（DQ903313、DQ988687）。S₄₀-和S₄₁-RNase基因推导的部分氨基酸序列分别与苹果属S₁₁-和S₆-RNase的同源性为100%和94.4%,这表明S-RNase的存在可能在梨属和苹果属形成之前。     

槜李等15个李品种S基因型鉴定及其多态性分析

利用李属S-RNase基因特异性引物,对15个供试李品种进行PCR扩增,共获得30个目的条带。对这些目的条带进行测序鉴定出15个李品种的S基因型。通过与NCBI中利用BLASTn与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB等数据库中的序列比对,结果表明,其中9个为新S-RNases基因,对9个新S-RNases核苷酸序列进行分析发现,位于高变区内的内含子大小为141～1758bp,其同源性为33.9%(S-18～S-19)～81.6%(S-20～S-21),表现出丰富的长度和序列多态性;编码区的核苷酸序列比对结果,其同源性为73.3%(S-16～S-19)～91.7%(S-17～S-22);其推导氨基酸序列相似性为67.3%(S-16～S-19)～89.1%(S-17～S-22);包含李属S-RNase一级结构所共有的C2、C3保守区和高变区(RHV)。系统进化分析表明,9个新S-RNases与李属其它树种S-RNases聚类在一起,归属为李亚科(Prunoideae)。     

20个苹果品种的S基因型鉴定

以‘富士’、‘华瑞’、‘华硕’和‘华星’等20个苹果品种为材料,利用S等位基因高度保守氨基酸序列FTQQYQ和anti-1/MIWPNV设计的S基因通用引物,以及S等位基因多态性序列设计的19对特异引物,PCR扩增、测序以鉴定20个品种的S基因型;并用‘华瑞’和‘华硕’分别与‘美八’、‘锦秀红’、‘华冠’和‘富士’进行授粉试验验证S基因型的准确性。PCR结果表明:通用引物扩增S等位基因时,仅‘富士’、‘华瑞’、‘华硕’、‘华星’、‘美八’和‘红脆宝’6个品种有效地扩增出2条特异的S等位基因条带,其S基因型有S1S_9、S_9S_(24)、S_5S_9和S_5S_(24)等4种;19对特异引物扩增S等位基因时,‘华帅’等14个品种扩增得到2条特异性条带,S基因型有S_(10)S_(19)、s_2s_3、s_2S_5、s_3S_(10)、s_2S_9、S_5S_(24)、S_9S_(10)、s_3S_(10)和S_5S_9等9种。因此,20个苹果品种的S基因型分别为:‘富士’S1S_9,‘华瑞’和‘华硕’S_9S_(24),‘华星’、‘美八’和‘红珍珠’S_5S_9,‘红脆宝’、‘华玉’和‘99-1-29’S_5S_(24),‘华帅’S_(10)S_(19),‘金玉’s_2s_3,‘早红’、‘华美’和‘嘎拉’s_2S_5,‘Seokwang’s_3S_(10),‘锦秀红’、‘蜜玉’和‘华冠’s_2S_9,‘绿佳’S_9S_(10),‘信浓红’s_3S_(10)。2015和2016年‘华瑞’与‘华硕’的正反交组合坐果率较低(低于15.52%);而‘华瑞’和‘华硕’分别与‘美八’、‘锦秀红’和‘华冠’、‘富士’品种的正反交组合坐果率较高(高于46.30%)。因此,本试验中相同S基因型的授粉组合其坐果率较低,不同S基因型的授粉组合其坐果率较高,授粉试验支持S基因型鉴定结果。     

60个苹果新品种S基因型鉴定

绝大多数苹果品种具有自交不亲和的特性，生产中需要搭配授粉树完成异花授粉。在苹果中已经分离鉴定了50多个S-RNase基因，对于一些新选育品种的S基因型至今未得到鉴定。利用S-RNase基因特异性PCR分析的方法鉴定了60份苹果新种质资源的S基因型，在60份苹果种质资源中，有56份品种的S基因型是首次鉴定到，并首次鉴定到了一个红肉苹果品种‘红色之爱’的S基因型，其S基因型是S19S？。新品种S基因型的鉴定能够为苹果育种亲本的选择及授粉树的合理搭配提供依据。     

8个中国梨品种S基因型的分子鉴定

为鉴定8个中国梨品种的S基因型,使用梨自交不亲和基因(S-RNase)特异引物"FTQQYQ"和"anti-ⅡWP-NV",对8个梨品种的基因组DNA进行特异扩增,并对扩增片段进行回收、克隆、测序。使用生物信息学软件对各序列分析和经同源性搜索分析后,确定了各品种的S基因型。结果分别是:兰州花长把为S19S22,青面为S1S18,黄面为S1S12,早蜜为S19S29,大面黄为S1S19,无子黄为S28S16,大青皮为S34S19及金锤子为S16S19。     

中国樱桃泰山干樱S-RNase基因的克隆及序列分析

以中国樱桃品种泰山干樱为试材,利用李属植物C2、C5保守区引物,扩增花柱S-RNase基因,获得4个S等位基因,测序结果表明序列大小分别为:1608、950、796、504bp。根据同源比较发现大小为796bp的等位基因与基因库中登录的S1-RNase为同一基因,其它3个S-RNase基因为首次报道,依序列大小分别命名为S2(1608bp,登陆号EF541168)、S4(950bp,登陆号EF541173)和S6(504bp,登陆号EF541172)。序列分析表明S2-RNase在C3区存在终止密码子,导致翻译提早终止;S4-RNase的C5区前有插入片断;S6-RNase在高变区比其它S等位基因少一个氨基酸残基。氨基酸序列同源性比较分析表明,中国樱桃S-RNase与樱花、扁桃的相似性高。在系统进化树中中国樱桃的4个S-RNase基因的氨基酸序列和樱花、扁桃、甜樱桃、酸樱桃等一起归于李亚科。     

枇杷属植物3个新S基因鉴定及大渡河枇杷分类地位的新证据

【目的】鉴定枇杷属普通枇杷野生种、栎叶枇杷和大渡河枇杷3个种的S-RNase基因型,为利用其优良性状开展种质创新,以及大渡河枇杷分类地位的探讨提供科学依据。【方法】以苹果S-RNase基因高度保守区设计兼并引物对3个种的基因组DNA进行PCR扩增,片段回收、克隆及测序,分别采用BLASTn、BLASTx、DNAMAN和CLUSTALW软件进行同源性检索、序列比对和结构分析。【结果】从参试的3个种中共分离了4个S等位基因,分别为S2-RNase、S26-RNase、S32-RNase和S34-RNase,其中S26-RNase、S32-RNase和S34-RNase为新分离的枇杷S-RNase基因,GenBank登录号分别为:MG765271、MG846012和MG812504。所克隆获得的4个枇杷S-RNase基因与苹果S-RNase基因的氨基酸序列结构相同,具有5个保守区(C1、C2、C3、RC4和C5)和1个高变区(HV)。此外,所获得的4个枇杷S-RNase基因电泳图谱及同源性和进化分析结果表明,大渡河枇杷可能为普通枇杷和栎叶枇杷的杂交后代。【结论】确定了普通枇杷野生种、栎叶枇杷和大渡河枇杷的S-RNase基因型分别为S2S26、S32S34和S26S32。大渡河枇杷S-RNase基因型及S-RNase的同源性和系统进化分析结果支持其可能为普通枇杷和栎叶枇杷杂交后代的结论。     

6个梨品种S基因型鉴定及新基因S_(45)-RNase序列分析

梨是典型的配子体自交不亲和果树,生产上需要配置授粉树才能获得理想的产量。鉴定梨品种的S基因型能够为合理配置授粉树提供理论依据。为鉴定S基因型,设计特异性引物对6个中国原产梨品种的基因组DNA进行扩增,片段回收、克隆、测序。使用生物信息学软件对各序列进行分析,确定6个梨品种S基因型分别为:宝珠S22S42,半斤酥S5S21,张掖长把S19S22,贵德长把S19S22,满顶雪S4S15,水冬瓜S15S45。其中S45为新分离鉴定的梨S-RNase基因,GenBank登录号为:EF643634。S45和梨S26的相似性最高,但高变区有5个氨基酸差异。     

福建新记录入侵害虫木瓜秀粉蚧的分子检测鉴定

【目的】基于核糖体28S rDNA基因序列的种特异性PCR方法,快速鉴定福建新纪录入侵性害虫——木瓜秀粉蚧(Paracoccus marginatus Williams and Granara de Willink)。【方法】通过1对扩增粉蚧28S rDNA的通用引物(S3660/A335)扩增以木瓜秀粉蚧为靶标,以野外采集的另外10种粉蚧为对照的11种粉蚧的基因片段序列。根据所得基因序列结果并参照GeneBank数据库中已知粉蚧的28S rDNA基因序列,设计出木瓜秀粉蚧28S rDNA的种特异性引物(28S-ParF/28S-MarR),对该种特异性引物的效果进行检验。【结果】该种特异性引物对木瓜秀粉蚧的28S rDNA基因具有扩增能力,得到产物大小为446 bp的扩增片段,对其他10种粉蚧均无扩增效果。该引物不仅对木瓜秀粉蚧雌成虫具有稳定的扩增效果,对不同虫态、不同寄主来源以及不同地区来源的木瓜秀粉蚧均有稳定的扩增效果。【结论】对福建发现的木瓜秀粉蚧进行分子鉴定并建立了木瓜秀粉蚧快速分子检测技术,可用于识别和防控木瓜秀粉蚧,有助于遏制木瓜秀粉蚧的入侵危害。     

中国樱桃S-RNase基因PCR扩增技术体系的建立

通过对TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTP、通用引物、模板DNA浓度等反应参数的系统研究,建立了中国樱桃S-RNase基因特异PCR扩增体系。该体系反应的总体积25μL,其中Taq酶1.25U,MgCl22.5mmol/L,dNTP0.15mmol/L,通用引物0.25μmol/L,模板DNA 50 ng。反应程序为:94℃预变性3 min;33个循环的94℃变性1 min,56℃退火45 s,72℃延伸1.5 min;最后72℃延伸10 min。利用优化的扩增体系在中国樱桃的不同品种中获得有效扩增,进一步证明了该体系具有良好的稳定性和重复性。     

‘金坠梨’自交亲和性突变机制的初步研究

 自交不亲和性品种鸭梨的芽变品种‘金坠梨’自花授粉能结实, 但其自交亲和性突变机制至今不祥。本研究结果表明, 鸭梨自花授粉结实率仅2% , 自花花粉管在花柱中上部已经停止生长, 而金坠梨自花授粉结实率高达76% , 自花的花粉管能正常生长至花柱基部; 鸭梨花柱能够接受金坠梨花粉并受精结实, 而金坠梨花柱却与鸭梨花粉杂交不亲和; 进一步鉴定出了鸭梨和金坠梨基于S-RNase基因的S基因型, 发现两者S基因型相同, 均为S₂₁S₃₄ ; 通过克隆两品种S-RNase基因cDNA全长序列并进行比较分析发现, 该两品种的1对雌蕊S-RNase基因在核苷酸序列上完全相同, 且S-RNase基因均正常表达, 表达量没有明显差异, 从分子水平上证实了金坠梨在花柱方面和鸭梨并无差异, 可能是花粉S 基因发生突变, 导致了自交不亲和性功能的丧失, 表现出自花授粉能够结实。     

白菜抗霜霉病基因的RAPD标记

研究了与抗霜霉病基因紧密连锁的RAPD分子标记, 利用白菜抗病品种014和感病品种010杂交的F₂群体144个单株为材料, 通过人工接种鉴定, 采用高抗单株和高感单株分别构建抗、感病池, 利用BSA法筛选了560条RAPD引物, 其中引物AY12在抗感病池中扩增出多态性片段AY12₁₂₃₈ , 通过F₂单株验证后证明AY12₁₂₃₈与抗霜霉病基因紧密连锁, 其遗传距离为6.7 cM。     

不同引物组合对中国杏品种资源S基因特异扩增效果比较

 利用已报道的5对蔷薇科李属通用引物组合对起源于我国的30个杏(Prunus armeniaca L.)品种进行了S等位基因的专一性PCR扩增（S-allele specific PCR），并依据扩增系数和扩增成功率两个指标对扩增效果进行了评价。结果表明：①不同的引物组合对参试杏品种的扩增系数和扩增成功率差异很大，其中引物组合EM PC2consFD+EM PC3consRD扩增系数和扩增成功率均为最高（66.7%和53.3％），效果最好；②引物组合EM PC2consFD+EM PC3consRD对‘华县大接杏’和‘猪皮水杏’未能扩增出任何条带，而PruC2+PruC4R和PaConsⅡ F+PaConsⅡ R两对组合却能对其扩增出两条带；此外，5对组合均没有对‘兰州大接杏’和‘白木杏’这两个品种扩增出任何条带，表明要对中国杏品种资源的S基因型进行全面、准确鉴定，除了采用不同的引物组合外，还需要根据中国杏的S基因序列进一步开发、设计新的专用引物；③ EM-PC2consFD+EM PC3consRD和PruC2+PruC4R两对组合对‘红丰’、‘新世纪’、‘红荷包’和‘二花槽’等4个品种的扩增结果表明，依据本试验所提出的扩增系数和扩增成功率两个指标评价不同引物组合的扩增效果是有效的。     

甘蓝一代杂种S 单元型的分布

利用SRK 基因激酶区的3 对特异性引物,对23 份甘蓝一代杂种进行PCR 扩增,经过克隆测
序、Blast 分析初步鉴定甘蓝一代杂种的S 单元型。结果表明：供试23 份材料中共出现了11 个S 单元型,
分别是S7、S16、S28、S35、S45、S57、S68 和未知的Sn 等8 个Ⅰ类S 单元型及S2、S5、S15 等3 个Ⅱ
类S 单元型。其中,Ⅱ类S 单元型的S5 出现频率最高,达到19.6%;其次为Ⅰ类S 单元型的S28,达到
17.4%。相比甘蓝类作物中存在的50 多个S 单元型而言,本试验材料涉及的S 单元型并不多,预示在遗传
育种中利用更多的S 单元型是十分必要的。     

甜樱桃S基因型PCR鉴定技术研究

绝大部分甜樱桃品种自交不亲和,因此自交不亲和基因型的鉴定对于生产具有重要的意义。以甜樱桃主栽品种为试材,建立基于PCR技术的甜樱桃品种S基因型鉴定技术。试验根据已发表的樱桃S基因序列设计了2对引物组合BFP73/74,BFP93/94,结合S1、S5基因的特异扩增引物,利用扩增片段长度的不同,就可以对樱桃品种的S基因型进行鉴定。通过对已知S基因型品种基因组的扩增,最终建立了基于PCR技术的甜樱桃品种S基因型鉴定技术。