伏马菌素B1胶体金免疫层析试纸条的研制

[目的]建立用于快速检测伏马菌素B1(FB1)的胶体金免疫层析试纸条。[方法]首先制备了FB1单克隆抗体和FB1-OVA偶联抗原,然后将FB1单克隆抗体与胶体金制成金标抗体包被在金标垫上,将FB1-OVA抗原和羊抗鼠Ig G包被在硝酸纤维素膜(NC膜)表面分别作为检测线和质控线。采用间接竞争法检测待检样品中的FB1与NC膜上的FB1-OVA抗原竞争结合金标抗体中的FB1单克隆抗体情况,并以检测线和质控线显示检测结果。[结果]本试验优化了金标抗体、检测抗原及羊抗鼠Ig G的包被量,检测FB1的灵敏度可达到2 ng·m L-1,最佳判定质量浓度为40 ng·m L-1。[结论]本试验制备的检测试纸条具有较高的特异性和稳定性,操作简单,检测时间仅需10 min,且与高效液相色谱法检测结果一致,可作为检测玉米中伏马菌素B1残留的有效手段。     

四环素全抗原的合成及多克隆抗体的制备

利用Mannich反应合成四环素(Tc)与BSA(牛血清白蛋白)的完全抗原,由紫外光谱确定是否偶联成功;同理,制备四环素OVA抗原作为包被抗原,以制备的完全抗原TC-BSA免疫清洁级新西兰兔制备多克隆抗体,运用间接ELISA法测定血清抗体效价。试验结果表明,紫外光谱确定偶联成功,血清抗体效价为105,间接竞争法测定抗体50%抑制率(IC50)检测限为200ng/mL,最低检测限量可达到20ng/mL,特异性好。     

应用B.melitensis 16M单克隆抗体建立羊布病的胶体金免疫层析检测体系

[目的]用B.melitensis16M提纯的LPS和O链抗原作为检测抗原,研制出针对B.melitensis16M的单克隆抗体(McAb),将其标记胶体金,建立一种诊断布病的胶体金免疫层析方法。[方法]B.melitensis16M全菌免疫Balb/C小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备McAb,测定免疫球蛋白亚类及亲和力。用HiTrapProteinGHP亲和层析纯化抗体并用胶体金标记,建立胶体金免疫层析方法。选择最佳反应模式组装成试纸条,对其特异性、敏感性、稳定性、阳性病料试验。[结果]筛选出能稳定分泌抗B.melitensis16M的种特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株2D10、3C6、1E10,单抗亚类分别为IgG2a、IgG1,亲和常数(k)介于1×10-8￣2.6×10-10。根据配对实验,以3C6为最佳包被抗体,2D10为最佳金标抗体。抗体IgG标记浓度为30μg/ml时,检测效果最佳。同时,与B.melitensis16M多抗IgG作为包被抗体、2D10为金标抗体的检测体系对比,两种包被方法组装的试纸条最低检出量为5.0×103CFU/ml,且不与其它菌发生交叉反应,保持期≥100d。以荧光定量PCR为参照,试纸条检测80份阳性病料,检检出率为100%。[结论]建立的胶体金免疫层析方法检测B.melitensis16M快速、简便、可靠,有望开发成为布病快速诊断试剂盒。     

水产品中恩诺沙星残留胶体金免疫层析技术的研究

[目的]制备一种特异、快速、便捷的检测虾及鱼肉中恩诺沙星残留的胶体金免疫层析试纸条。[方法]用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金标记恩诺沙星多克隆抗体,喷于试纸的金标垫。将ENR-OVA(恩诺沙星和卵清白蛋白的偶联物)和纯化的羊抗兔IgG分别喷于试纸的T(检测线)处和C(质控线)处,通过挑选试纸条材料和调试工艺参数,并最终组装成试纸条。[结果]制备的试纸条检测体系方法的检出限为0.9 ng/ml。试纸条对虾及鱼肉中的恩诺沙星残留的检出限分别为5和10 ng/g。[结论]制备的恩诺沙星胶体金检测试纸适用于现场实际样品恩诺沙星残留水平检测,具有良好的应用前景。     

快速检测联苯菊酯的胶体金层析试纸条研制

[目的]采用免疫胶体金技术,建立一种快速检测联苯菊酯的试纸条方法。[方法]利用有机合成方法制备了联苯菊酯半抗原,并与载体蛋白偶联得到免疫抗原,利用人工免疫的方法获得其单克隆抗体,通过酶联免疫法对制备的单克隆抗体的性能进行了验证。联苯菊酯胶体金层析试纸条是利用单克隆抗体标记胶体金,并将联苯菊酯抗原与羊抗鼠Ig G分别喷制到硝酸纤维膜上,与样品垫、吸水垫组装在PVC衬板上制备而成。[结果]联苯菊酯胶体金层析试纸条检测限为500~800μg/kg,具有速度快、简单等优点。此外,该试纸条与大部分的拟除虫菊酯没有明显的交叉反应,利用该试纸条可实现对苋菜中联苯菊酯添加试验的准确判定。[结论]胶体金试纸条方法具有前处理简单、检测速度快、可以肉眼判断结果等优点,该试纸条有望实现对果蔬中联苯菊酯残留的快速筛查。     

猪口蹄疫金标快速检测卡在免疫检查中的应用

<正>1监测卡的原理检测卡利用抗体快速金标检测卡法(简称金标法)检测抗体效价。金标法是在酶联免疫吸附法的基础上发展起来的一种固相标记免疫测定新技术。其检测原理是,以微孔滤膜为载体,包被已知抗原,加入待检标本后,经滤膜的毛细管作用,标本中的抗体与胶体金结合的抗原相结合,再通过与膜上包被的抗原结合显色而达到检测目的。金标法的试剂为试纸条形式,即为金标试纸条。判定标准:口蹄疫抗体阳性≥1:32(5log2);口蹄疫抗体阴性1:32(5log2)。     

金标法与ELASA检测3种猪病的对比试验

正1检测卡的原理检测卡利用抗体快速金标检测卡法(简称金标法)检测抗体效价。金标法是在酶联免疫吸附法的基础上发展起来的一种固相标记免疫测定新技术。其检测原理是以微孔滤膜为载体,包被已知抗原,加入待检标本后,经滤膜的毛细管作用,标本中的抗体与胶体金结合的抗原相结合,再通过与膜上包被的抗原结合显色而达到检测目的。金标法的试剂为试纸条形式,即为金标试纸条。判定标准:猪瘟、口蹄疫抗体阳性≥1:32(5log2),蓝耳抗体阳性≥1:40;猪瘟、口蹄疫抗体阴性1:32(5log2),蓝耳抗体阴性1:40。     

免疫金试纸法快速检测盐酸克伦特罗

试验选取自身蛋白制备克盐酸伦特罗克伦特罗载体抗原,免疫动物后产生高效价的特异性抗体,纯化抗体与胶体金结合成免疫金,制备成简易的检测试纸条。通过检测试纸条敏感性、保存期、金标抗体工作浓度选择、操作方法对比、实验检测及与单抗金标试纸条平行检测等试验,证明建立的免疫金试纸法快速检测盐酸克伦特罗具有实用性、可靠性和稳定性。自身全血清作载体可使抗盐酸克伦特罗的ELISA效价高达4万以上。免疫金试纸法对盐酸克伦特罗的最小检测量为40ng·mL-1,试纸条在室温保存150d不影响检测结果。实验检测86份ELISA试剂盒阴性样品和42份阳性样品,其符合率分别为100%和95.2%。市售单抗金标试纸条检测结果与ELISA法的阳性符合率为95%(19/20)。     

重氮化法合成全抗原的研究

[目的]制备氯霉素全抗原,探索氯霉素合成的方法,为动物免疫试验作准备。[方法]采用重氮化法合成氯霉素卵清蛋白全抗原,通过紫外法和红外光谱法测定合成的偶联效果。[结果]重氮化法可用于制备较高偶联率的氯霉素全抗原,用于免疫动物制备抗体。[结论]该研究为合成高效价的抗体奠定了基础。     

汞离子胶体金免疫层析试纸条的研制

基于特异性识别汞离子的单克隆抗体,以胶体金标记抗体作为检测探针,样品中的汞离子和检测线上的包被抗原竞争与免疫探针结合,建立了一种快速测定水样中汞离子的胶体金免疫层析试纸条方法.在最优实验条件下,试纸条对汞离子的检出限为100μg/L,与其他金属离子没有交叉反应,样品的加标回收实验结果与酶联免疫吸附分析方法(ELISA)有很好的相关性.整个分析过程在10min内可以完成,表明该方法可以快速直接检测汞离子,不需要复杂的样品预处理过程.     

水产品中孔雀石绿·结晶紫及其代谢物残留快速检测试纸条的研制

[目的]研究开发用于现场检测水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留的快速检测试纸条。[方法]采用胶体金免疫层析技术,通过利用不同的样品垫及反应模式进行试验,研制出适合于现场检测水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留的快速检测试纸条。[结果]该试纸条对孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫的检测限均为2μg/L,检测所需时间约10 min。[结论]该试纸条操作简便、快速、检测灵敏度高,试验结果一目了然,可作为孔雀石绿、结晶紫及其代谢物在水产品中残留检测的有效筛查手段。     

快速检测生鲜乳中玉米赤霉醇试纸条的研制及其应用

[目的]采用免疫胶体金技术,建立了一种快速检测玉米赤霉醇的试纸条方法。[方法]利用有机合成方法,研制了一种玉米赤霉醇半抗原,将其载体蛋白偶联得到免疫抗原,并通过人工免疫的方法获得单克隆抗体。通过酶联免疫法对制备的单克隆抗体的性能进行了验证。玉米赤霉醇层析试纸条是利用单克隆抗体标记胶体金,其原理是玉米赤霉醇抗原和羊抗鼠Ig G分别喷到自制的膜(硝酸纤维)上,然后将样品垫、吸水垫分别放置在PVC板上,再制成试纸条。[结果]试纸条检测限可达0.5~1.0μg/kg,具有速度快、简单等优点。此外,该试纸条与大部分的玉米赤霉醇没有明显的交叉反应。[结论]利用该试纸条可实现对生鲜乳中玉米赤霉醇添加试验的准确判定。该试纸条有望实现对生鲜乳中玉米赤霉醇残留的快速筛查。     

同时快速检测马铃薯X病毒、Y病毒和S病毒试纸条的研制

为实现在马铃薯种薯生产田现场同时快速检测马铃薯X病毒(PVX)、Y病毒(PVY)和S病毒(PVS),采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,利用抗体与胶体金相结合的特性制备金原子与PVX、PVY和PVS抗体结合物(简称金标抗体),通过三维划膜喷金仪将金标抗体喷射于玻璃纤维上作为金标垫,将PVX抗体、PVY抗体和PVS抗体分...     

五氯酚钠胶体金快速检测试纸条的研制

[目的]研制五氯酚钠胶体金快速检测试纸条。[方法]利用胶体金免疫层析技术,研制一种快速检测猪肉、鸡肉、鱼、虾、水质中五氯酚钠的试纸条。[结果]经测试,该试纸条对猪肉、鸡肉、鱼、虾的检测限为1μg/kg,对水质的检测限为2μg/kg,检测时间为15 min,假阳性率和假阴性率均为0。[结论]该方法准确、可靠,使用简便,适合大量样品的现场检测。     

胶体金免疫层析法快速检测水产品中四环素类药物残留

为建立用于快速检测水产样品中四环素类药物残留含量的胶体金免疫层析检测试剂,采用免疫竞争法,将抗四环素单克隆抗体-胶体金复合物包被在胶体金结合垫上,并将人工合成的四环素抗原包被在硝酸纤维素薄膜表面作为检测线(T线),其残留药物与待测样品中四环素竞争结合胶体金标记的四环素单克隆抗体,最终能以颜色直观显示检测结果。检测水产品试样时,试剂灵敏度最低值可达100 ng/mL,仅需5~10min,与金霉素、土霉素、强力霉素等四环素族抗生素有很强的交叉反应,故可同时检测四环素族中几种主要抗生素,而与沙丁胺醇、莱克多巴胺等其他兽药无交叉反应。试验证明检测试剂具有较高的灵敏度及特异性,操作便捷,稳定可靠,可作为四环素残留现场监控的有效筛检手段。     

魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制

【目的】研制魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,为魏氏梭菌病的快速诊断提供新方法。【方法】采用分子生物学方法制备魏氏梭菌α毒素,将其免疫家兔制备多克隆抗体。用制备的抗魏氏梭菌α毒素多克隆抗体作为胶体金标记抗体和检测线上的捕获抗体,制备魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,对其特异性、敏感性、稳定性和重复性进行检测。用制备的魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条对临床样品进行检测,比较其检测结果与PCR检测结果的符合率。【结果】成功制备了魏氏梭菌α毒素多克隆抗体。成功研制了α毒素快速诊断金标试纸条,其检测线上抗体的最适包被质量浓度为0.06 μg/mL。研制的试纸条仅与魏氏梭菌α毒素发生反应,且不同批次的试纸条重复检测结果无差异,表明试纸条具有较高的特异性和重复性;该试纸条最低可检测1.40 mg/mL的毒素量,与PCR方法测得结果符合率为80.77%,基本能满足实际应用要求。【结论】成功研制了魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,该试纸条具有快速、特异、敏感、稳定等优点,适用于对魏氏梭菌病进行普查和检疫,具有良好的应用前景。     

斑点免疫金渗滤法诊断猪蛔虫病

[目的]探讨斑点免疫金渗滤法诊断猪蛔虫病的可行性,为制备诊断猪蛔虫病试剂盒提供参考依据。[方法]采用猪蛔虫的重组蛋白AS16抗原和胶体金标记葡萄球菌蛋白A（SPA）,根据免疫渗滤原理,建立抗猪蛔虫抗体的斑点金免疫渗滤检测法。[结果]斑点免疫金渗滤法检测1200份猪血清样本中猪蛔虫抗体,检出阳性率为25.00%,而琼脂扩散试验（AGP）阳性检出率为15.00%。[结论]斑点金免疫渗滤检测法具有操作简便,灵敏度高,特异性强的优点,可用于猪蛔虫病的快速检测。     

胶体金免疫层析法快速诊断犬弓首蛔虫病

[目的]建立了一种能快速诊断犬弓首蛔虫病方法。[方法]以胶体金标SPA和犬弓首蛔虫（Toxocara canis）抗原蛋白制备免疫层析试纸条,并对其灵敏度和特异性进行评价。采用该试纸条和虫检法对200份犬血清样本进行检测,以评价该试纸条对现场材料的检测效果。[结果]组装的犬胶体金免疫层析试纸条的最低检测线为0.20μg/ml,灵敏度很好;与犬的其他寄生虫病的阳性血清进行反应,均成阴性;对200份犬血清样本的阳性检出率为10%,而虫检法的阳性检出率为2%。[结论]胶体金免疫层析法诊断犬弓首蛔虫病具有操作简便、灵敏度高、特异性强的优点,可用于犬弓首蛔虫病的快速检测。     

PCR－核酸试纸条法快速检测鸽子源性成分

[目的]提高动物源性成分检测效率,建立PCR-核酸试纸条快速检测技术体系。[方法]针对物种特异性DNA序列,设计并标记引物;建立并优化PCR反应体系;利用通用核酸试纸条进行结果判读。[结果]试验表明,PCR-核酸试纸条特异性高;绝对灵敏度为0.001 3 ng/μL,混合样品,实际灵敏度为0.01%;加工处理样品,实际灵敏度为0.1%;最低检测限检出率为100%,稳定性良好。[结论]综上,PCR-核酸试纸条方法是一种既有PCR反应的高灵敏度,又具有免疫学检测的特异性好的特点,同时操作简便的快速检测方法。