蒙古沙冬青AmWRKY53基因表达分析及表达载体构建

以蒙古沙冬青为试材,分离到1个编码WRKY类转录因子基因,命名为AmWRKY53。该序列包含1个长为1 065bp的开放阅读框,编码354个氨基酸,具有1个WRKYGQK结构域和1个C_2HC锌指基序,属于Ⅲ型WRKY转录因子。荧光定量PCR方法检测了非生物胁迫下AmWRKY53在叶和根组织中的表达特点。结果表明:AmWRKY53受干旱和高盐诱导,参与逆境胁迫应答。构建的pPZP212-AmWRKY53植物表达载体,为进一步研究AmWRKY53的功能奠定了基础。     

西瓜ClWRKY54基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

WRKY转录因子是植物中所特有的一类转录因子,以基因家族形式存在,并在植物的生长发育和逆境响应等过程中发挥重要的作用。采用RT-PCR的方法从西瓜中分离得到一条西瓜CIRKY54基因。序列分析表明,该基因开放阅读框全长1 428 bp,编码475个氨基酸。其编码蛋白分子量约为51.82 KD,等电点为6.17。该基因蛋白序列中包含2个WRKY保守结构域,锌指结构为C2H2型,属于典型的1类WRKY基因。进化树分析显示,该基因蛋白序列同葫芦科作物中的甜瓜、黄瓜、西葫芦等的WRKY26具有较高的同源性,处于同一分支上。亚细胞定位分析显示,该基因编码蛋白定位于细胞核中。对该基因进行荧光定量PCR分析研究其表达特性,结果显示该基因在西瓜根、茎、叶中均有表达,但是在叶片中表达量最高;H_2O_2可以诱导该基因的表达,而乙烯处理可以抑制该基因的表达,这说明该基因可能参与逆境下H_2O_2和乙烯所介导的信号途径。在模拟干旱下,该基因表达无变化,说明该基因同干旱胁迫抗性不相关。本研究的结果将为进一步的解析ClWRKY54的功能奠定基础。     

橄榄WRKY转录因子的克隆及其在低温胁迫下的表达分析

【目的】探讨橄榄WRKY转录因子的序列特征及其在生长发育与低温胁迫过程中的调控作用。【方法】以'福榄1号'橄榄为材料,采用RT-PCR技术克隆了4个WRKY转录因子家族成员(分别命名为CaWRKY21、CaWRKY33、CaWRKY50和CaWRKY55),并对其进行生物信息学和qRT-PCR表达模式分析,同时研究橄榄低温胁迫过程中总抗氧化能力的变化。【结果】CaWRKY21、33、50、55开放阅读框分别为561、1 644、357和1 044 bp,预测可分别编码186、547、118和347个氨基酸,GenBank登录号为MG356652、MG356653、MG356654和MG356655。生物信息学分析表明,CaWRKY21、33、50、55的密码子偏好性普遍较弱,均编码不稳定疏水性蛋白质,其中CaWRKY21和CaWRKY55属于第Ⅱ类植物WRKY转录因子,定位于细胞核内,CaWRKY33和CaWRKY50分别属于第Ⅰ类和第Ⅲ类WRKY转录因子,可能分别定位在内质网膜和细胞质中;聚类分析发现,橄榄与番木瓜、甜橙、桉树WRKY的亲缘关系较近。低温胁迫过程中,随着温度下降,橄榄总抗氧化能力和CaWRKY21、33、50、55表达水平均明显上升,在-3℃处理组中达到最高点;此外,它们均呈现器官特异性表达。【结论】WRKY转录因子可能参与橄榄器官形态建成,并且受低温胁迫显著诱导。     

低温胁迫下枇杷不同发育阶段的花果转录组比较分析

研究比较了枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)不同发育阶段花果的低温响应机制。以花蕾、完全开放的花和花后2周左右的幼果为试验材料,–3℃低温处理12 h,以未经低温处理样品为对照,测定生理生化指标并进行转录组测序分析。低温胁迫导致细胞膜破坏,超氧阴离子产生速率、丙二醛和脯氨酸含量、抗氧化酶活性明显升高。总体上抗低温能力为花蕾花幼果。转录组测序分析共获得6 987个差异表达基因(DEG),对这些基因进行通路注释分析,发现大量与低温胁迫相关的代谢途径,其中碳水化合物代谢中的糖酵解/糖异生、乙醛酸和二羧酸代谢及磷酸肌醇代谢途径,氨基酸代谢中的色氨酸代谢和酪氨酸代谢途径,酯类代谢中的甘油磷脂代谢、α–亚麻酸代谢和甘油酯代谢途径,次生代谢中的异喹啉生物碱生物合成途径以及能量代谢中的硫代谢途径在3个花果发育时期低温与对照的比较组中显著富集,说明这几个途径都是枇杷花果响应低温胁迫的重要代谢途径。"苯丙烷类生物合成"途径在前两个时期比较组中富集水平较高,氨基酸代谢相关途径在幼果比较组中富集更多。另外,从低温处理相关差异表达基因中筛选到了53个AP2-EREBP基因,14个WRKY基因和15个NAC基因,并对其中12个低温响应相关转录因子基因进行了qRT-PCR表达分析,进一步证实了转录组数据的准确性。     

甘蓝型油菜DOF蛋白基因的克隆与生物信息学分析

Dof转录因子是植物特有的一类转录因子,含有一个独特的单锌指结构域,在植物的生长发育中起重要的调控作用。以甘蓝型油菜为试材,采用电子克隆和RT-PCR技术,以期克隆一个具有Zf-Dof结构域的蛋白基因cDNA序列。结果表明:该基因含有1284bp的开放阅读框,编码427个氨基酸,蛋白分子量为46.9kDa,等电点为8.86,为亲水性蛋白。经序列比对分析表明其与拟南芥CDF3基因有较高同源性,可能具有相似的功能。     

一个辣椒肌醇半乳糖苷合成酶同源基因的全长cDNA克隆与低温表达分析

采用RT-PCR结合RACE技术,从低温处理的辣椒(Capsicum annuum L.)品种“苏长红”叶片中克隆得到一个肌醇半乳糖苷合成酶同源基因（GS）的cDNA序列(GenBank登录号：EF566470), 其全长1 444 bp, 推断其编码336个氨基酸。序列分析表明该基因与其他高等植物的GS基因具有较高的同源性。利用RT-PCR技术分析辣椒受低温胁迫后该基因的表达情况,发现该基因常温下在辣椒各组织中均无表达,经4 ℃或10 ℃处理6 h后在叶片中开始表达,而茎和根系中无论低温处理与否均不表达。Southern杂交结果表明辣椒基因组中还存在其他GS同源基因。     

白菜病程相关蛋白1基因cDNA全长的克隆与分析

 以水杨酸处理后的‘苏州青’白菜为材料, 通过RT2PCR和RACE技术, 获得了白菜病程相关蛋白PR-1基因的cDNA全长序列。该基因与甘蓝型油菜PR-1基因氨基酸序列的同源性为91% , 与拟南芥的同源性为78% , 与其它植物的同源性为57%～60%。Southern杂交表明该基因在白菜基因组中的拷贝数至少为2个。半定量RT2PCR分析表明, 2 mmol/L的水杨酸处理后12 h, 该基因的表达量达到高峰。     

矮牵牛B-box型锌指蛋白基因PhBBX8的克隆与表达分析

利用矮牵牛（Petunia hybrida）基因表达谱芯片筛选出应答低温胁迫的相关基因,从中发现1个B-box型锌指蛋白基因PhBBX8。通过RT-PCR克隆得到该基因的编码区序列（CDS）,为1 242 bp,预测其编码氨基酸413 aa,N端含有2个B-box盒,C端含有1个CCT结构域。系统进化树分析发现,PhBBX8与拟南芥AtBBX8等聚类为一支。利用半定量RT-PCR检测其在根、茎、叶和花中的表达特性,结果表明该基因在花中表达量较高,其次为根,而在茎和叶中表达较弱;利用实时定量PCR检测了在低温、干旱、ABA、MeJA、高盐和高渗胁迫处理下矮牵牛叶片中PhBBX8的诱导表达情况,结果表明,PhBBX8表现出不同程度的上调,其中除干旱胁迫外,其他胁迫下上调倍数都较高,初步推测该基因与矮牵牛应答低温等非生物逆境相关。     

扁桃AcCBF1转录因子的克隆及表达分析

【目的】分离和克隆新疆栽培扁桃CBF1转录因子基因,了解其在扁桃响应环境胁迫和逆境相关激素诱导的表达情况。【方法】以新疆扁桃幼苗为试验材料,对其进行低温、干旱、盐及ABA处理,使用PCR技术从新疆扁桃‘双果’克隆得到CBF1转录因子基因,通过农杆菌将35S-Ac CBF1-GFP融合质粒转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察结果,并通过实时荧光定量PCR技术分析了SG-Ac CBF1转录因子基因在不同非生物逆境胁迫下的表达情况。【结果】序列分析表明,该基因编码框为729 bp,编码242个氨基酸,蛋白质分子量为27.405 ku,命名为SG-Ac CBF1,GenBank登录号为KM245571。氨基酸序列同源比对分析证实,SG-Ac CBF1属于CBF转录因子家族基因。系统发育树分析表明,SG-Ac CBF1与甜樱桃Pa DREB1的亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示,SG-Ac CBF1蛋白定位于细胞核中。实时荧光定量PCR分析结果表明,低温、干旱、盐及ABA均能诱导SG-Ac CBF1基因表达。【结论】SG-Ac CBF1转录因子具有核定位功能,并参与了植物对逆境胁迫的调控。由于该转录因子属于家族基因,因此其对环境胁迫响应的强弱还有待探讨。     

菜薹抽薹相关基因BrcuDFR-like/BrcuAXS 的克隆与表达特性分析

 为了预测抽薹相关基因BrcuDFR-like/BrcuAXS 的功能,通过PCR 和RACE 的方法克隆了菜薹BrcuDFR-like/BrcuAXS 基因的cDNA 和gDNA 全长序列。结果表明：该基因编码区全长1 332 bp,编码312 个氨基酸残基。对应的gDNA 全长为2 460 bp,含有8 个外显子和7 个内含子,内含子总长为1 042bp,其中第3 个内含子最长,为401 bp。内含子中含有多个基本转录元件和顺式作用元件,如光应答元件、赤霉素响应元件、参与抗性和胁迫应答元件、热响应元件、WRKY 转录因子的结合位点及干旱胁迫元件MYB 转录因子结合位点等。利用半定量RT-PCR 分析表达模式,发现BrcuDFR-like/BrcuAXS 随菜薹花芽形态逐步建成直至抽薹开花,其表达量逐渐增强,与其它物种DFR-like 基因的表达模式更吻合,由此预测该基因在菜薹生长发育阶段编码DFR-like 酶的可能性大于编码AXS 的可能性,其功能可能与菜薹营养分生组织向花分生组织转变有关。     

盐碱胁迫下羊草转录因子的转录组分析

以羊草为试材,采用罗氏454二代测序方法,研究了羊草转录因子家族在逆境胁迫条件下来自38个家族的243个转录因子表达差异模式,以期揭示WRKY、C3HL、NAC等转录因子家族差异基因数量,探讨羊草的抗逆分子机制。结果表明:羊草转录组测序片段经de novo拼接共获得104 105条Unigene序列,对照含有97个转录因子基因,盐碱处理组含有213个转录因子,其中67个转录因子为2组共表达。差异基因表达分析揭示羊草主要通过WRKY、C3HL、NAC转录因子家族的差异表达调控盐碱适应性。该研究为耐盐碱型作物培育奠定了基础。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过SON-PCR结合RT-PCR技术获得了1个冷诱导转录因子CBF/DREB家族基因编码区全长cDNA序列,命名为FaCBF1,GenBank登录号为FJ767754。该基因包含1个长为636 bp的完整开放阅读框,编码211个氨基酸,预测分子量为23.4 kD,等电点为6.53。氨基酸同源性分析表明,FaCBF1与GenBank中登录的蔷薇科植物CBF/DREB具有较高的同源性。进化树分析表明,草莓FaCBF1与近缘属的月季、苹果和沙梨处于同一进化枝上,而与李属植物进化关系较远。半定量RT-PCR分析显示,FaCBF1能被低温、干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA诱导不敏感;在同一诱导时期在根中的表达量高于叶和茎中的表达量。     

菊花乙烯响应因子CmRAP2-12的克隆与表达特性分析

以菊花(Chrysanthemum morifolium)品种‘神马’为试材,采用RT-PCR与RACE、Real-time RT-PC等技术,克隆了菊花乙烯转录因子CmRAP2-12基因全长的cDNA序列片段,Real-time RT-PCR分析了水淹胁迫对菊花CmRAP2-12基因的表达模式的影响,以期降低水淹条件下对菊花生长的迫害性影响。结果表明:得到的CmRAP2-12的cDNA序列为1 335bp;CmRAP2-12保守氨基酸的N末端含有一个具有ⅦERFs亚家族特征的氨基酸序列,且聚类到RAP2-12亚家族一类,并预测亚细胞定位在细胞核中。Real-time RT-PCR分析显示,CmRAP2-12在菊花的根、茎、叶中均有表达,并且在经过0~72h的淹水胁迫后,CmRAP2-12基因在菊花根系中的表达量均呈现一个先升高后降低的趋势,并在处理后48h达到最高值,淹水胁迫提高了菊花根系乙烯响应转录因子RAP2-12的表达水平。该试验将为进一步研究RAP2-12对提高菊花水淹低氧耐受性的调节机理与分子响应机制提供参考依据。     

湖北海棠MhWRKY40b 在几种胁迫下的表达分析

 为了分析WRKY40抗病抗逆作用,以湖北海棠[Malus hupehensis（Pamp）Rehd.]为试材,利用特异引物进行RT-PCR基因克隆,利用实时荧光定量PCR方法分析组织中基因的表达及低温、高盐、干旱、PEG6000胁迫和外源IAA、ABA处理对基因表达的影响。结果表明,克隆到的片段长度为1 240 bp,包含一个完整的开放阅读框,长999 bp,编码333个氨基酸。该基因与拟南芥AtWRKY40同源,故命名为MhWRKY40b,GenBank登录号为JX112913。基因表达分析表明,MhWRKY40b在根、茎、叶等组织均有表达,其中在花萼、花辨、果实中表达量较高。该基因明显受低温、高盐、干旱胁迫诱导表达,最高相对表达量可达20倍以上;而受PEG、苹果白粉病菌及外源ABA和IAA轻微诱导,最高相对表达量在10倍以下。MhWRKY40b除了在抗白粉病方面与AtWRKY40具有相似功能外,可能还在湖北海棠的抗寒、抗盐、抗旱过程中起到比较重要的作用。     

刺葡萄0943抗白腐病转录因子VdWRKY49的克隆及序列分析

【目的】获得来源于中国野生抗病种质刺葡萄0943的转录因子Vd WRKY49基因,揭示其序列特征、基因功能与抗葡萄白腐病之间的关系,初步揭示抗病种质抗病机制。【方法】利用同源克隆的方法分别获得刺葡萄0943的转录因子Vd WRKY49基因的编码区和启动子区域,分析其序列特征,通过实时荧光定量检测其对白腐病菌和水杨酸诱导的反应,同时以感病品种欧亚种‘黑比诺’为对照,分析不同种质中的转录因子Vd WRKY49基因序列及表达差异。【结果】来源于中国野生种质刺葡萄0943的Vd WRKY49基因,在其编码区和启动子区域都有抗病基因的序列特征和位点特征,同时也存在不同,在DNA和氨基酸水平上与来源于欧亚种的‘黑比诺’Vv WRKY49有差异,这些差异可能造成了其结构功能的差异;受到葡萄白腐病和水杨酸诱导后,Vd WRKY49基因的表达量明显高于Vv WRKY49。【结论】来源于刺葡萄0943的Vd WRKY49基因受到白腐病菌和水杨酸诱导后表达量和表达模式明显区别来源于‘黑比诺’的Vv WRKY49基因,推测在葡萄抗病途径中转录因子WRKY49具有重要的生物学作用。     

香蕉抗逆相关基因MaERF的克隆与表达分析

 根据已获得的AP2/ERF基因片段,通过RACE方法获得一个香蕉ERF基因完整编码区序列,命名为MaERF。该基因cDNA全长1 611 bp,其中开放阅读框1 128 bp,编码376个氨基酸,包含一个保守的AP2/ERF结构域,基因组序列全长2 881 bp,含有一个内含子,剪切位点符合“GT-AG”规则;系统进化树表明该基因属于植物ERF转录因子家族的B2亚群。半定量RT-PCR分析表明,该基因在香蕉各个器官中均有表达,其中在根和叶中的表达量较低,而在果实和花中的表达较高;实时荧光定量Real-time PCR检测表明,受尖孢镰刀菌侵染及低温胁迫后,香蕉中该基因表达明显上调,推测其在香蕉胁迫反应中可能发挥重要作用。     

龙眼水通道蛋白基因(DLPIP1)的克隆与表达分析

应用蛋白质组学研究低温胁迫下龙眼叶片蛋白质组变化时,发现PIP1蛋白在龙眼低温胁迫中上调表达。应用RACE技术克隆龙眼水通道蛋白基因全长cDNA,命名为DLPIP1,基因登陆号为JN572691,长度为1 132 bp,包括1个900 bp的开放阅读框,编码299个氨基酸序列,同源性分析表明,DLPIP1在21个不同植物中的一致性为90%~93%。应用生物信息学软件对DLPIP1氨基酸序列分析表明,含有7个跨膜区,有2个NPA单元,其氨基酸残基与MIP家族蛋白保守区序列完全一致。氨基酸序列比对发现,该序列与其他物种PIP质膜水通道蛋白氨基酸序列有很高的同源性。利用实时荧光定量技术对DLPIP1在低温胁迫下不同组织表达谱分析表明,DLPIP1在龙眼根、茎、叶中都有表达,在根中的表达量最高,其次是茎和叶。DLPIP1在低温胁迫时,随着低温胁迫时间的延长而发生变化。这说明DLPIP1蛋白在龙眼低温逆境过程中起作用。     

茎瘤芥AP2/EREBP 转录因子基因BjABR1 的克隆和表达分析

 以茎瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee）‘永安’为材料,通过RACE 和RT-PCR 技术得到1 个AP2/EREBP 转录因子基因的cDNA 全长序列和基因组DNA（gDNA）序列,该基因与拟南 芥AtABR1 基因的氨基酸序列相似性高达72%,因此命名为BjABR1（GenBank 登录号：JQ713825.1）。BjABR1 基因gDNA 序列含1 个内含子;cDNA 序列全长1 514 bp,含有1 个1 146 bp 的开放阅读框（ORF）,编 码381 个氨基酸;其推定编码的蛋白分子量为41.674 kD,等电点为9.11,具有14 个磷酸化位点,含1 个典型的AP2 DNA 结合域和1 个CMX-1 基序。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,BjABR1 蛋白定位于细 胞核。荧光定量PCR 分析结果表明,该基因在茎瘤芥不同发育时期的根、茎、叶中均有表达,但在根中 表达量极高;在对茎瘤芥组培幼苗进行高盐、渗透压和低温3 种非生物胁迫处理后发现,3 种胁迫均能诱 导该基因表达,但其对高盐的响应更为迅速。     

辣椒乙烯反应转录因子基因CaJERF1 的克隆及诱导表达

 应用RT-PCR、RACE技术从乙烯诱导的辣椒中克隆到一个乙烯反应（ERF）类转录因子基因,命名为CaJERF1,其全长cDNA序列为1 379 bp,编码375个氨基酸,分子量为41.5 kD,具有一个由59个氨基酸构成的保守的ERF结构域。CaJERF1的AP2域与CaPF的同源性为100%,与JERF1的同源性为99%;全序列与CaPF和JERF1的同源性也分别达到99%和86%,属于ERF家族的第Ⅳ次家族。诱导分析表达结果表明,植物激素乙烯、苿莉酸甲酯以及盐和低温胁迫均可诱导该基因的表达,表明CaJERF1可能参与到多条信号途径中,并在多种逆境胁迫应答中发挥作用。     

低温胁迫下龙眼碳酸酐酶基因（CA）的克隆与表达分析

 应用蛋白质组学研究低温胁迫下龙眼叶片蛋白质组变化时发现碳酸酐酶（CA）蛋白下调表达。利用RT-PCR方法克隆CA基因的全长cDNA,GenBank登录号JN033201,长度为1 119 bp,包括1个966 bp的开放阅读框,编码321 bp的氨基酸序列,同源性分析表明,12个不同植物同源性为81% ~ 88%。龙眼CA基因具有典型的CA结构域,并且非常保守。实时荧光定量分析结果表明,CA在龙眼根、茎、叶中都有表达,为组成型表达,在叶中的表达量最高,茎和根中的表达量最少。CA基因在低温胁迫下随着低温胁迫时间的延长而发生变化。将CA在大肠杆菌中表达,获得1个约40.5 kD的外源蛋白。推测CA表达与低温胁迫有关。