蜡梅胚胎晚期丰富蛋白基因CpLEA的克隆及表达分析

从蜡梅 （Chimonanthus praecox）花cDNA文库中获得了1个胚胎晚期丰富蛋白（LEA）基因的cDNA全长序列,命名为CpLEA（GenBank登录号：JF412788）,该基因cDNA含有一个273 bp编码91个氨基酸的开放阅读框,从蜡梅基因组DNA中扩增该基因发现,该基因含有两个大小分别为35 bp和707 bp的内含子。生物信息学分析显示,CpLEA的编码蛋白含有4个胚胎晚期丰富蛋白第3族LEA蛋白特有的11个氨基酸的基元重复序列,进化树分析表明该编码蛋白与榛子的LEA蛋白亲缘关系最近。通过原核表达获得了与预期大小一致的融合蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在蜡梅成熟种子中表达量最高,在根中几乎不表达;在盛开期花的各个部位中又以雌蕊中的表达量最高;在花发育早期表达量较高,随后下降并保持相对稳定,在衰败期突增并达到最高;检测该基因在脱落酸（ABA 50 μmol · L^-1）、低温（4 ℃）、高温（42 ℃）、干旱（30% PEG6000）和高盐（NaCl 1 mol · L^-1）5种外源非生物胁迫因子作用下的表达特性。结果表明,该基因能够被ABA、低温、高温、PEG 和NaCl诱导表达,并在随后的时间内呈现出不同的表达模式。表明CpLEA可能在蜡梅花发育和多种非生物胁迫响应中发挥作用。     

苹果MdMYB2基因对非生物胁迫的响应

为阐明苹果(Malus×domestica)R2R3-MYB转录因子基因MdMYB2在非生物胁迫条件下的生物学功能,对MdMYB2的启动子序列进行分析,发现其含有非生物胁迫相关顺式作用元件,且MdMYB2的表达量受外源ABA、聚乙二醇(PEG)和4℃低温的诱导。在不同处理对MdMYB2过表达拟南芥植株和MdMYB2过表达苹果愈伤组织的试验中发现,外源ABA处理抑制了MdMYB2转基因拟南芥种子的萌发,且转基因幼苗提高了对ABA的敏感性、耐旱性和抗冷性。同时,过表达MdMYB2的苹果愈伤组织也表现出对ABA敏感、耐旱和抗冷的表型。以上结果说明MdMYB2在植物的逆境胁迫响应中发挥重要作用。     

苹果生长素阻遏蛋白基因MdIAA26的分子克隆与功能鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果（Malus × domestica Borkh.）中克隆了一个生长素阻遏蛋白家族基因（基因序列号MDP0000164095）。测序发现,该基因包含长为978 bp完整的开放阅读框,编码325个氨基酸。系统进化树分析表明,这一生长素阻遏蛋白与拟南芥IAA26同源序列相似性最高,因此将该基因命名为MdIAA26。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测分析发现,MdIAA26启动子序列中含有与脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、水杨酸（SA）及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdIAA26在苹果的各组织中均有表达,在根和叶片中表达量相对较高;苹果组培苗中MdIAA26的表达明显受到ABA和IAA的诱导。MdIAA26过量表达的苹果愈伤组织在外源ABA处理下和MdIAA26异位表达拟南芥在外源ABA、PEG和IAA处理条件下,生长势均明显比野生型对照强,表明MdIAA26降低了对ABA和IAA的敏感性和对干旱的抗性。     

环境胁迫下大头芥花青素积累及其相关结构基因的表达

以大头芥（红叶大头芥）为试材,研究模拟干旱、低温和强光等环境胁迫下红叶大头芥中花青素含量及其与花青素合成途径中CHI、DFR和ANS等结构基因表达的关系。首先通过同源克隆法在红叶大头芥中克隆了CHI、DFR和ANS基因,其开放阅读框分别为759、1 157、1 004 bp,分别编码253、385、334个氨基酸。实时荧光定量RT-PCR结果表明,在环境胁迫下,红叶大头芥中花青素的积累和结构基因的大量表达需要一定处理时间的诱导。CHI基因在强光、低温和模拟干旱胁迫下的表达量无明显变化,且表达量极低|而DFR和ANS基因在低温、强光胁迫下的转录表达量随胁迫时间的延长而增加,对红叶大头芥中花青素的合成起到了重要的调控作用,且强光胁迫下DFR和ANS的表达量约为低温胁迫的两倍,推测低温和强光胁迫可能诱导了红叶大头芥中花青素合成途径不同的调控机制。     

柑橘CitMYB40转录因子的克隆与表达分析

【目的】分析R2R3-MYB家族成员Cit MYB40的生物学功能,为柑橘抗逆基因筛选和抗逆生理机制探索提供依据。【方法】以‘资阳’香橙(Citrus junos‘Ziyang’)为试材,采用生物信息学和基因表达技术,通过不同器官组织比较、植物激素和非生物胁迫处理,研究Cit MYB40的表达规律,并预测其基本生物学功能。【结果】Cit MYB40基因的开放阅读框(ORF)为984 bp,可编码297个氨基酸残基多肽。该基因含有3个内含子、4个外显子,与葡萄Vv MYB39、胡杨Pe MYB86、马铃薯St MYB34、麻风树Jc MYB34等同源蛋白的相似度为45.57%~53.51%。实时定量分析发现,Cit MYB40基因在植株不同组织器官间的表达具有明显差异,在花中的表达量最高,根中最低。在植物激素作用下,叶中的表达量明显高于根中,但ABA、SA、Me JA、ACC均可诱导Cit MYB40基因在根和叶中的表达。在非生物胁迫下,PEG6000、Na Cl和4℃低温均对Cit MYB40的表达有上调作用,且Na Cl处理时,Cit MYB40基因在根和叶中的表达模式与PEG6000处理相似。【结论】柑橘Cit MYB40在不同组织中的表达存在显著差异,并受不同植物激素和非生物胁迫诱导,推测其在柑橘生长发育和逆境响应中起到了一定的作用。     

菠萝AcZFP1的克隆及其在低温胁迫下的功能分析

以‘神湾’菠萝为材料,克隆了1个C2H2型锌指蛋白基因,命名为AcZFP1,其开放阅读框为816bp,编码271个氨基酸,含有2个典型的锌指蛋白结构域。进化树分析表明AcZFP1与水稻Os ZFP252和OsMSR15的亲缘关系最近。基因表达分析发现,AcZFP1受低温、NaCl和聚乙二醇（PEG）干旱等多种逆境胁迫及外源ABA、SA和MeJA的诱导。试验表明,AcZFP1蛋白定位于细胞核中。AcZFP1过表达的拟南芥株系在低温处理后相比野生型对照有更高的成活率和Fv/Fm值,可溶性蛋白含量增加,SOD、POD酶活增强,MDA含量降低,植株的耐寒性显著增强。进一步的qRT-PCR分析显示,AcZFP1可以促进AtRD29A、AtCOR47等4个典型的拟南芥内源冷应答基因的表达,在低温胁迫中发挥正调控作用。     

辣椒中ABA介导的干旱胁迫响应相关基因CaDRT1的鉴定与功能分析

植物时常受到高盐和干旱等各种各样的环境胁迫,因此植物也进化出了各种防御机制以应对胁迫所带来的毒害作用。脱落酸(ABA)是一种植物激素,调控植物的生长发育并对非生物胁迫产生响应。本研究从经ABA处理的甜辣椒(Capsicum annuum)叶片中鉴定出了一个耐旱基因Ca DRT1(Drought Tolerence 1)。Ca DRT1基因在叶片中的表达受环境胁迫大幅诱导。经ABA处理后,Ca DRT1在辣椒叶片中大量表达,表明Ca DRT1蛋白在非生物胁迫响应中具有着重要功能。通过病毒诱导基因沉默(VIGS)技术沉默Ca DRT1基因后,叶片气孔关闭受限,蒸腾失水量上升,植株受到显著伤害。Ca DRT1过表达(Ca DRT1-OX)的拟南芥在发芽期、幼苗期及成株阶段均呈ABA敏感的表型。此外,Ca DRT1-OX植株呈耐旱表型,其特点是气孔关闭程度高,蒸腾率低,叶片温度高,叶片中干旱应答基因表达量增加。上述结果表明Ca DRT1在ABA介导的干旱胁迫响应中起正向调控的作用。     

矮牵牛B-box型锌指蛋白基因PhBBX8的克隆与表达分析

利用矮牵牛（Petunia hybrida）基因表达谱芯片筛选出应答低温胁迫的相关基因,从中发现1个B-box型锌指蛋白基因PhBBX8。通过RT-PCR克隆得到该基因的编码区序列（CDS）,为1 242 bp,预测其编码氨基酸413 aa,N端含有2个B-box盒,C端含有1个CCT结构域。系统进化树分析发现,PhBBX8与拟南芥AtBBX8等聚类为一支。利用半定量RT-PCR检测其在根、茎、叶和花中的表达特性,结果表明该基因在花中表达量较高,其次为根,而在茎和叶中表达较弱;利用实时定量PCR检测了在低温、干旱、ABA、MeJA、高盐和高渗胁迫处理下矮牵牛叶片中PhBBX8的诱导表达情况,结果表明,PhBBX8表现出不同程度的上调,其中除干旱胁迫外,其他胁迫下上调倍数都较高,初步推测该基因与矮牵牛应答低温等非生物逆境相关。     

枣树ZjSOD1基因参与非生物胁迫响应的研究

【目的】克隆1个枣树超氧化物歧化酶基因ZjSOD1,并对其功能进行研究,为其在枣树抗逆基因工程改良中的利用奠定基础。【方法】采用PCR克隆ZjSOD1 cDNA序列,运用实时定量RT-PCR方法研究其在高盐和PEG6000胁迫下转录水平的变化。构建ZjSOD1过量表达载体转化拟南芥,研究其在拟南芥中响应非生物胁迫应答的功能,测定氧化酶活性及生理指标。【结果】ZjSOD1基因cDNA序列开放阅读框全长为699 bp,编码232个氨基酸,理论等电点为8.59,属于Fe-SOD家族成员。在转录水平上,ZjSOD1明显受NaCl和PEG6000诱导。在拟南芥中过量表达ZjSOD1基因导致植株对干旱、高盐更加敏感,但对H_2O_2耐受性显著增强。在NaCl、PEG6000和H_2O_2胁迫条件下,过量表达ZjSOD1转基因植株中SOD、CAT和POD酶活性、脯氨酸和丙二醛含量、电解质渗透率均显著发生改变。实时定量RTPCR结果显示参与活性氧(ROS)、高盐和干旱胁迫相关信号通路的基因在ZjSOD1转基因株系中表达量发生明显改变。【结论】ZjSOD1在植物生长发育过程中参与氧化、干旱、高盐胁迫应答。     

茶树DHAR酶基因的克隆与非生物胁迫响应分析

利用RT-PCR技术从茶树‘龙井43’cDNA中克隆得到1个编码茶树脱氢抗坏血酸还原酶基因CsDHAR，该基因全长639 bp，编码212个氨基酸，属于谷胱甘肽转移酶（GST）超级家族成员，具较高保守性。系统进化分析结果表明CsDHAR蛋白与拟南芥DHAR1、DHAR2进化关系近，在不同物种间，与毛果杨、胡杨等植物亲缘关系较近；理化性质分析表明CsDHAR属于亲水性蛋白；结构分析表明CsDHAR蛋白具典型功能结构域，三级结构主要由α–螺旋和不规则卷曲构成。荧光定量PCR分析显示，CsDHAR在茶树叶片不同发育阶段表达量差异不显著；对‘龙井43’与‘安吉白茶’中CsDHAR进行荧光定量PCR分析，‘龙井43’在低温、高温处理4 h表达量最高、干旱和高盐处理24 h表达量最高；‘安吉白茶’在高温、高盐处理4 h表达量最高，干旱处理2 h表达量最高。不同逆境胁迫下CsDHAR均被诱导表达，表明该基因参与茶树响应逆境胁迫调节过程。     

菜薹BrWRKY57的特性及其对BrPPH1和BrNCED3的调控

从菜薹叶片中分离获得1个WRKY转录因子,命名为BrWRKY57。氨基酸序列比对及进化树分析发现BrWRKY57与拟南芥AtWRKY57同源性较高,含有1个WRKY保守结构域,且同属于WRKY转录因子家族Ⅱc亚族。实时荧光定量PCR分析表明,BrWRKY57随着菜薹叶片衰老表达水平升高,外源脱落酸(abscisic acid,ABA)处理显著诱导其表达。亚细胞定位和转录活性分析表明,BrWRKY57定位于细胞核,且在酵母和烟草体内都具有转录激活活性。双荧光素酶瞬时表达试验显示,BrWRKY57可以激活叶绿素降解相关基因BrPPH1和ABA合成相关基因BrNCED3的启动子活性。以上研究结果表明,BrWRKY57参与菜薹叶片衰老过程可能与影响叶绿素降解和ABA合成相关基因的表达有关。     

外源NO对干旱胁迫下平邑甜茶幼苗叶绿素荧光参数和光合速率的影响

 以20%聚乙二醇（PEG6000）处理模拟干旱,利用一氧化氮（nitric oxide,NO）供体硝普钠（sodium nitroprusside,SNP）处理平邑甜茶[Malus hupehensis（Pamp.）Rehd.]幼苗,探讨外源NO对水分胁迫下平邑甜茶幼苗叶绿素荧光参数和光合速率的影响。结果表明：水分胁迫下平邑甜茶幼苗Fo显著上升,F_v/F_m、q_P、ETR、Yield、叶绿素含量和光合速率显著降低,q_N在胁迫的前3 d呈上升趋势,之后大幅度下降;通过外施不同浓度的SNP（100 ~ 700 μmol · L^-1）均使水分胁迫下平邑甜茶幼苗 F_o上升及F_v/F_m、ETR、q _P、Yield、叶绿素含量和光合速率下降幅度明显减小。不同处理缓解作用为：300 μmol · L^-1 SNP > 500 μmol · L^-1 SNP > 100 μmol · L^-1 SNP > 700 μmol · L^-1 SNP,其中300 ~ 500 μmol · L^-1 SNP处理缓解效应明显,但以300 μmol · L^-1 SNP处理效果最好。     

氮胁迫对平邑甜茶水培苗的生理效应

以当年生平邑甜茶(MalushupehensisRehd.)实生苗为试材,用水培实验方法,研究氮胁迫对其引起的生理效应。通过8周的处理,对平邑甜茶的功能叶和根系进行相关指标的检测,结果如下:用电导仪进行抗逆性测定,伤害率由大到小依次为功能叶、吸收根、生长根和木质根。N胁迫影响了功能叶和根系中的N代谢。与MN(middleN)相比,N胁迫各处理的可溶性蛋白含量均下降。功能叶中游离氨基酸总量表现为HN(highN)>LN(lowN)>MN,而根系中表现为MN>HN>LN。各器官中,以功能叶和吸收根对N胁迫最为敏感。N胁迫还改变了功能叶和吸收根内的ABA、IAA、ZRs、GA3的含量,从而影响了激素平衡。此外,通过电镜观察可知,N胁迫破坏了叶绿体和吸收根根尖细胞的超微结构。     

缺锌胁迫对苹果砧木幼苗抗氧化能力和激素含量的影响

 在人工气候室条件下,采用溶液培养法研究了缺锌胁迫对平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd.）和小金海棠（M. xiaojinensis Cheng et Jiang）两种苹果砧木幼苗SOD、POD和CAT的活性,膜质过氧化水平及内源激素IAA、GA3、ZR和ABA含量的影响。结果表明,缺锌胁迫下,两品种叶片和根系中SOD活性显著下降,POD和CAT活性、MDA含量不同程度增加,但小金海棠SOD活性下降幅度较平邑甜茶小,POD和CAT活性增加比例大,且MDA积累量低。缺锌使两种砧木幼苗不同器官中IAA、GA3含量显著降低,ZR、ABA含量增加;小金海棠缺锌植株IAA、GA3、ZR含量较平邑甜茶高,ABA含量低。平邑甜茶缺锌植株膜质过氧化水平高,对缺锌胁迫较敏感,小金海棠在缺锌胁迫下抗氧化能力强,促进生长的激素含量高,对缺锌胁迫有较强的抵御和耐受能力;平邑甜茶缺锌植株膜质过氧化水平高,对缺锌胁迫较敏感。     

干旱胁迫下外源ABA对姜叶片活性氧代谢的影响

为探讨外源ABA调控姜干旱胁迫的生理机制,以‘莱芜大姜’为试材,采用砂培,通过模拟干旱（5% PEG）和根系外施ABA（0.05 mmol ? L-1）,研究ABA对姜叶片活性氧代谢的影响。结果表明,外源ABA显著增加了姜叶片内源ABA含量,且以干旱胁迫下增加量为最多;同时,外源ABA亦有利于保持姜叶片较高的相对含水量。姜根系外施ABA早期,植株叶片的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）及过氧化氢酶（CAT）活性均增强,进而显著降低了叶片中超氧阴离子（）产生速率及过氧化氢（H2O2）含量,延缓了膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量的增加;虽外源ABA处理后期,随干旱胁迫时间的延长,外施ABA处理植株叶片抗氧化酶活性有所降低,但其活性氧水平及MDA含量仍显著低于单一的干旱胁迫处理。表明外施0.05 mmol ? L-1ABA有利于维持姜叶片活性氧代谢的正常进行,降低膜脂过氧化水平,增强植株抗干旱能力。     

平邑甜茶MhHSP70的特征及其对镉和渗透胁迫的反应

 以平邑甜茶为试材,通过RT-PCR及RACE技术,获得了一个热激蛋白基因HSP70的全长cDNA序列,命名为MhHSP70,GenBank登录号为HQ876864;该基因全长2 307 bp,序列高度保守,编码650个氨基酸,与苹果、番茄和烟草亲缘关系最近。在根系和叶片中,热激蛋白基因MhHSP70的表达均受镉和渗透胁迫（非热胁迫）诱导,并且随着硫酸镉和氯化钠处理浓度的升高以及聚乙二醇（PEG）处理时间的延长,MhHSP70的表达量逐渐增强。     

外源物质对干旱复水平邑甜茶抗氧化酶的影响

以苹果砧木平邑甜茶2a生实生苗为材料进行盆栽试验,研究比较了干旱复水条件下外源甜菜碱(GB)、脱落酸(ABA)和硝普纳(SNP,NO供体)对平邑甜茶幼苗抗氧化防护酶活性的影响。结果表明:外源GB、ABA和NO显著降低了干旱胁迫下平邑甜茶幼苗叶片质膜相对透性和MDA含量,重度胁迫时与CK相比,分别降低了13.5%、12.2%、18.4%与32.4%、14.4%、37.6%;外源GB、ABA和NO提高了叶片中SOD、CAT和POD的活性,在田间持水量30%时分别达到最大,与同期CK相比,POD活性分别增加13.5%、13.4%和24.4%,SOD活性分别增加15.3%、13.7%和16.2%,CAT活性则分别增加63.2%、53.7%和95.3%,之后酶活性开始下降。外源GB、ABA处理后GR、DHAR、APX和MDHAR的变化趋势与CAT等趋势相同,同样在田间持水量30%时酶活分别达到最大;NO处理后,GR、DHAR、APX的变化趋势亦相同,虽然NO对MDHAR活性比干旱处理有所升高,但差异不显著。复水后,不同外源物质下植物的抗旱生理指标变化趋势不尽相同。表明喷施外源GB、ABA和NO可有效的提高叶片的抗氧化系统酶的活性,增强平邑甜茶幼苗的抗旱能力。比较GB、ABA和NO处理,NO在提高平邑甜茶抗旱性方面效果最好,GB处理其次,ABA处理最低。