昆虫几丁质合成酶B基因的研究进展

几丁质是昆虫的主要组成成分，由于几丁质不存在于植物和无脊椎动物中，被认为是环境友好型农药的设计靶标。几丁质合成酶B是几丁质合成路径中的最后一个关键酶，近些年已成为国内外研究的热点内容。根据国内外对昆虫几丁质合成酶B基因功能的研究，综述了几丁质合成酶B对几丁质合成的调控研究进展，包括时空表达特性、基因功能、基因在害虫防治中的研究、并对RNA干扰技术应用存在的问题及解决途径进行了展望。     

利用RNA干扰技术沉默稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因

稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)是一种主要的水稻害虫,几丁质合成酶是昆虫体内几丁质合成通路中的一个关键酶,在昆虫生长发育中具有重要作用,是控制害虫的理想靶标。本文采用RNA干扰(RNAi)技术,以稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因(CmCHSA)为靶标,设计两个靶位点CmCHSA-I和CmCHSA-II,在体外分别合成其双链RNA(dsRNA),用显微注射法导入3龄幼虫体内,然后通过表型观察和荧光定量PCR(RT-q PCR)检测干扰效应。结果表明,注射两种dsRNA后纵卷叶螟对水稻的取食明显下降,生长发育阻滞,虫体变小变黑和畸形,有的出现死亡。RT-q PCR表明,注射CmCHSA-I和CmCHSA-II两种dsRNA在96 h后,CmCHSA的表达量相比对照分别下降了59%和64%。注射CmCHSA-I和CmCHSA-II两种dsRNA 7 d后,稻纵卷叶螟的死亡率分别为80%和83.33%,与对照组相比,分别增加了66.67%和70%。本研究用注射法RNAi技术成功实现了对稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因的沉默,为利用该技术研究昆虫基因的功能,以及通过转基因RNAi技术防治稻纵卷叶螟奠定了基础。     

RNA干扰技术在农作物害虫防治中的应用

RNA干扰(RNAi)技术作为基因沉默的工具,已被广泛应用于农作物害虫防治研究。准确选择靶基因、将dsRNA或siRNA导入昆虫体内、siRNA在昆虫体内的扩增和扩散是RNAi技术应用于农作物害虫防治的基础。应用RNAi技术能有效地保护农作物抵抗害虫危害,在农作物遗传改良进行精准抗虫方面具有重大的应用前景。     

RNA沉默在植物与根结线虫互作基因研究中应用

基因沉默或RNA干扰（RNA interferance,RNAi）是双链RNA诱导的序列特异性基因沉默,是转录后水平上对基因的表达进行负调控。随着植物与根结线虫相互关系的研究的深入以及基因工程技术的发展,揭示了基因工程方法防治线虫危害的新途径。最近研究表明,dsRNA基因在植物体内表达,线虫取食这种转基因植物后线虫致病力下降并使植物有效抵抗多种根结线虫。这种转基因植物具有有效低抗线虫危害特性,而且其抗性是广谱的。该文对RNAi的研究历史、植物根结线虫抗性基因以及RNAi技术防治根结线虫的新途径等方面的研究进展进行了综述。     

转CmTre1基因RNA干扰水稻的室内和田间抗虫性鉴定

稻纵卷叶螟是一种主要的水稻害虫,海藻糖酶是昆虫几丁质合成通路上的关键酶之一。该研究对转稻纵卷叶螟可溶性海藻糖酶基因(CmTre1)双链RNA(dsRNA)水稻进行了室内和田间抗虫性鉴定。叶片测定结果表明,取食转CmTre1基因dsRNA水稻株系608的稻纵卷叶螟死亡率为70.00%,校正死亡率为50.95%。定量PCR检测表明,幼虫取食608株系后其体内CmTre1基因的mRNA水平下降59.00%,该基因的表达被抑制。田间抗虫性检测结果表明,608株系的卷叶率为15.06%,白叶率为13.98%,与对照差异显著。转CmTre1基因RNA干扰(RNAi)水稻对稻纵卷叶螟具有抗性。该研究为利用RNAi技术对稻纵卷叶螟进行绿色防控奠定基础。     

昆虫几丁质代谢与植物保护

正几丁质是昆虫外骨骼和围食膜的重要组成成分,昆虫蜕皮和生长发育依赖于几丁质合成和降解的精细调控。几丁质代谢酶参与昆虫表皮和围食膜几丁质的形成,在昆虫蜕皮发育等生命活动中具有重要的生理功能,利用几丁质代谢酶的调控作用研发分子靶标,在植物保护领域具有潜在的应用价值。RNA干扰(RNAi)技术作为反向遗传学研究的有效工具,在昆虫基因功能研究方面发挥了重要作用,同时在害虫控制方面展示出广阔的应用前景~([1-4])。RNAi技术的发展也推动了昆虫几丁质代谢关键基因生物学功能的解析     

海藻糖代谢及其调控昆虫几丁质合成研究进展

海藻糖为一种非还原性糖,广泛存在于细菌、藻类、真菌、植物和无脊椎动物中。海藻糖被称为昆虫“血糖”,源于该糖为昆虫血淋巴中的主要糖类物质,在昆虫生长、发育、蜕皮等正常生理活动中有着重要的作用。昆虫的海藻糖先由海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase,TPS）生成海藻糖-6-磷酸,然后通过海藻糖磷酸脂酶（trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP）最终合成海藻糖,在能量需求时通过海藻糖酶（trehalase,TRE）降解为葡萄糖,用于能量供给。几丁质为昆虫表皮、中肠围食膜和气管系统的主要组成成分,昆虫在发育过程中需要蜕掉旧表皮,形成新的表皮,该过程一直是害虫控制的重要靶标途径。海藻糖酶为昆虫几丁质合成途径的第一个酶,在几丁质合成通路中有着重要的功能。那么海藻糖代谢又是如何调控几丁质合成途径来控制昆虫的蜕皮及几丁质代谢的呢？随着国内外海藻糖代谢相关基因功能研究的深入开展,研究结果表明昆虫海藻糖供给在几丁质合成中具有重要的作用,海藻糖酶分为可溶性和膜结合型两类,可溶性TRE和TPS在不同昆虫种类中具有多个同源基因,表明昆虫海藻糖代谢进化途径多样化。其次,海藻糖代谢直接调控几丁质合成途径,不论是海藻糖合成酶还是海藻糖酶基因的低表达,均能控制海藻糖使其供给不平衡,从而导致几丁质合成途径受阻,特别是几丁质合成酶基因表达降低而造成几丁质含量下降,该调控作用可进一步引起昆虫蜕皮困难、翅发育畸形等,甚至大量死亡。再次,海藻糖酶抑制剂能够抑制可溶性和膜结合型两类海藻糖酶活性、引起几丁质合成通路相关基因及几丁质酶基因表达的显著下降,导致几丁质含量显著降低,产生高比例的昆虫个体死亡。这些结果充分表明,一旦昆虫海藻糖代谢的供给平衡被打破,会直接影响到昆虫的几丁质合成乃至昆虫的蜕皮与发育过程。本文综述前人在海藻糖代谢调控几丁质合成方面的最新研究成果,为将来开发和利用海藻糖酶抑制剂及海藻糖合成酶抑制剂等绿色农药防治害虫提供理论依据。     

双价RNA干扰载体转基因水稻抗飞虱研究

借助转基因技术，培育稳定遗传表达靶向昆虫基因dsRNA的转基因植物，对于防治刺吸式害虫褐飞虱具有潜在意义。研究在已获得V-ATPase D和V-ATPase H亚基基因片段的融合基因，并通过体外合成dsRNA喂食褐飞虱若虫后导致死亡率增加的基础上，构建了该融合基因的pcambia 1300-Ubi-hp(VAD-H)-RNAi植物表达载体，转化日本晴水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.11)获得转基因植物，褐飞虱若虫取食转基因植株后飞虱体内靶标基因的转录水平有所下降，同时飞虱发育历期和世代周期有所延长，虽然没有造成飞虱的死亡，但双价RNAi载体的构建为利用RNAi技术进行植物抗飞虱研究奠定了基础，同时通过技术改进提高RNAi抗飞虱水平，可进一步培育出抗飞虱转基因水稻。     

白背飞虱海藻糖合成酶基因调控几丁质合成的功能

【背景】 海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase,TPS）在海藻糖合成中起着重要作用,其能够介导海藻糖代谢调控几丁质合成及昆虫发育。【目的】 本研究通过抑制白背飞虱（Sogatella furcifera）TPS的表达,检测RNAi沉默SfTPS效果,观察白背飞虱蜕皮状况,测定几丁质含量及几丁质合成酶（chitin synthase,CHS）基因的定量表达,探究SfTPS在白背飞虱几丁质合成中的潜在调控作用。【方法】 利用注射法RNAi技术,以实验室饲养多年的白背飞虱种群为试验材料,体外合成两个SfTPS（SfTPS1和SfTPS2）与GFP的双链RNA（dsRNA）后,分别注射到白背飞虱体内抑制TPS。首先,在dsRNA注射后48 h采用Trizol法提取白背飞虱的总RNA,反转录并合成第一链DNA后,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测TPS表达沉默情况,以确定RNAi的效果;其次,测定dsRNA注射后48 h和72 h白背飞虱整体几丁质含量并对翅发育畸形虫体进行拍照;最后,采用qRT-PCR技术检测白背飞虱SfCHS在mRNA水平上的相对表达量变化,分析SfTPS1和SfTPS2在几丁质合成调控中的作用。【结果】 与注射dsGFP相比较,dsSfTPS1和dsSfTPS2的RNA注射后,能够促进SfCHS表达量上升,几丁质含量增加,白背飞虱成虫翅出现畸形。qRT-PCR结果显示,单个SfTPS dsRNA注射后本基因的表达能够被极显著抑制,与注射dsGFP相比,不足对照组表达量的30%,且单个SfTPS的dsRNA注射后,另外一个SfTPS表达同样显著下降;dsSfTPS1和dsSfTPS2注射后,白背飞虱成虫翅均为长翅,出现一定比例的翅卷曲等畸形情况,其后48 h和72 h产生一定的死亡率;几丁质含量检测发现,SfTPS1和SfTPS2的dsRNA注射后72 h,几丁质含量显著上升。与注射dsGFP对照组相比较,SfCHS1与SfCHS1a表达量在dsSfTPS1注射后72 h极显著上升,在dsSfTPS2注射后48 h和72 h时极显著上升,且dsSfTPS1和dsSfTPS2注射后SfCHS1b的表达极显著增加。【结论】 SfTPS能够通过调控白背飞虱几丁质合成酶基因的表达来控制几丁质的合成,研究结果有助于评价SfTPS在白背飞虱等昆虫中的调控作用并作为潜在控害靶标,为进一步开展和筛选有效的海藻糖合成酶抑制剂控制白背飞虱等害虫提供理论依据。     

Efficiency of Different Methods for dsRNA Delivery in Cotton Bollworm (Helicoverpa armigera)

RNAi trigged by dsRNA not only facilitates the development of molecular biology, but also initiates a new way for pest control by silence of fatal genes. However, one of the key limitations in pest control is lack of the convenient and efficient method for dsRNA delivery. In this study, different dsRNA delivery methods at their own optimum conditions were evaluated comparatively for their efficiency with Helicoverpa armigera as test animal. It was found that the popular one- time injection of larvae with dsRNA could reduce the pupation rate by 43.0% and enhance larva mortality by 11.7%. One- time ingestion of dsRNA did not result in any significant effect on phenotype. Continuous ingestion of in vitro synthesized dsRNA by refreshing the bait diet every day caused 40.4% decrease in successful pupation and 10.0% increase in larval mortality, which was similar as one-time injection. The most efficient method was found to be the continuous ingestion of the bacteria containing dsRNA expressed, which reduced the rate of pupation by 68.7% and enhanced the larval mortality by 34.1%. Further analysis found that dsRNA was degraded faster in midgut juice than in hemolymph. However, the cell of bacteria could protect dsRNA and delay the degradation in the midgut juice of H. armigera. These results throw light on the application of dsRNA in pest management with proper ways.     

甜菜夜蛾UAP的克隆、时空表达及RNAi研究

【目的】在昆虫中,几丁质的合成对于其生长发育至关重要,虽然几丁质合成通路在真菌中的研究比较深入,但是在昆虫中,目前大多数的研究都集中在海藻糖酶和几丁质合成酶方面,而对于通路上其他基因的研究却非常少。论文旨在阐明昆虫几丁质合成通路中的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UAP）对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）几丁质合成酶基因和害虫存活的影响。【方法】以甜菜夜蛾5龄第1天幼虫的cDNA为模板,通过简并引物扩增出甜菜夜蛾UAP基因（SeUAP）的中间片段,然后利用特异性引物和RACE技术扩增出3′和5′ race序列,拼接得到cDNA全长。随后提取甜菜夜蛾各组织和各龄期的总RNA,并通过RT-PCR方法分析SeUAP在各个组织和龄期的表达情况。最后通过向甜菜夜蛾5龄第1天的幼虫注射dsUAP观察其生长状况,检测RNAi的效率以及对几丁质合成通路下游基因的影响。【结果】获得全长为2 098 bp的SeUAP cDNA,编码一个491个氨基酸残基的蛋白,与双翅目昆虫致倦库蚊、埃及伊蚊、黑腹果蝇和冈比亚按蚊的UAP亲缘关系较近。该基因在表皮和卵巢中大量表达,在气管和中肠中的表达次之,在马氏管中表达微弱,在脂肪体中则基本检测不到其转录本的存在。该基因在甜菜夜蛾生长发育的各个阶段均有表达,在卵的整个阶段、L22（幼虫2龄第2天）、L31、L42、L51、P0、P5、P7以及A3这些天中的表达量较高,其余天数表达量较低,其表达的高峰主要出现在几丁质需求量较高的时期。RNAi结果表明,通过向甜菜夜蛾5龄第1天的幼虫注射5 µg dsRNA,导致部分甜菜夜蛾出现蛹期畸形及死亡,并出现两种畸形现象：（1）虫体腹部蛹壳已基本形成并已硬化,但头部蛹壳形成有障碍,化蛹时无法突破旧表皮;（2）虫体头部蛹壳形成正常,也能正常突破旧表皮,但蜕皮过程仅到此为止,无法正常进行下去。定量PCR结果显示SeUAP的沉默对几丁质合成酶A基因（SeCHSA）下调不明显,而对几丁质合成酶B（SeCHSB）的表达有明显下调作用。【结论】UAP可以影响几丁质合成通路的下游基因并对甜菜夜蛾幼虫-蛹的生长发育起一定作用。     

中华稻蝗几丁质合成酶1基因的mRNA表达及功能

【目的】研究中华稻蝗（Oxya chinensis（Thunberg））几丁质合成酶1（CHS1）基因的表达特性及其在生长发育过程中的作用,从而为实现基于RNAi的蝗虫有效控制提供理论依据。【方法】根据已知中华稻蝗几丁质合成酶1基因（OcCHS1）保守区域部分cDNA序列（GenBank登录号：HM214491）设计特异性表达引物,运用RT-PCR和qPCR研究时空表达特性;采用RNA干扰技术研究其生物学功能。【结果】OcCHS1在中华稻蝗各龄期都有表达,其体表为高表达,其次是气管,其它组织部位表达量低。RNA干扰试验发现,4龄第4天若虫注射OcCHS1的双链RNA（dsRNA）后,与对照组相比,OcCHS1 mRNA表达量被沉默了70.8%,稻蝗出现蜕皮时间延迟、不能完成蜕皮或腹部皱缩死亡等现象,注射dsOcCHS1组死亡率为85.2%,与对照组（7.4%）相比差异显著。【结论】几丁质合成酶1对中华稻蝗的生长发育具有重要作用,其主要参与体表和气管几丁质的合成。采用RNA干扰技术使该基因沉默后可导致中华稻蝗死亡。     

RNAi及其在害虫防治中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由非编码的小分子双链RNA引发的序列特异性转录后基因沉默现象,普遍存在于线虫、真菌、昆虫和动植物等多种生物中。近年来,RNAi技术在昆虫中的成功应用为一系列新颖的、环境友好的害虫防治策略提供了理论依据。文章综述了RNAi技术的作用机制、dsRNA吸收机制及在害虫防治等领域的研究成果,并展望了该技术的应用前景。     

Efficiency of Different Methods for dsRNA Delivery in Cotton Bollworm （Helicoverpa armigera）

RNAi trigged by dsRNA not only facilitates the development of molecular biology, but also initiates a new way for pest control by silence of fatal genes. However, one of the key limitations in pest control is lack of the convenient and efficient method for dsRNA delivery. In this study, different dsRNA delivery methods at their own optimum conditions were evaluated comparatively for their efficiency with Helicoverpa armigera as test animal. It was found that the popular one- time injection of larvae with dsRNA could reduce the pupation rate by 43.0% and enhance larva mortality by 11.7%. One- time ingestion of dsRNA did not result in any significant effect on phenotype. Continuous ingestion of in vitro synthesized dsRNA by refreshing the bait diet every day caused 40.4% decrease in successful pupation and 10.0% increase in larval mortality, which was similar as one-time injection. The most efficient method was found to be the continuous ingestion of the bacteria containing dsRNA expressed, which reduced the rate of pupation by 68.7% and enhanced the larval mortality by 34.1%. Further analysis found that dsRNA was degraded faster in midgut juice than in hemolymph. However, the cell of bacteria could protect dsRNA and delay the degradation in the midgut juice of H. armigera. These results throw light on the application of dsRNA in pest management with proper ways.