小麦禾谷胞囊线虫(Heterodera avenae)的核糖体基因(rDNA)限制性片段长度多态性研究

 采用PCR技术扩增出中国和摩洛哥禾谷胞囊线虫群体的核糖体基因(rDNA)的内转录间隔区(ITS)片段的长度约为1 060 bp。用11种限制性内切酶(RE)酶切禾谷胞囊线虫ITS扩增产物,共产生27个酶切片段。用AluI和RsaI酶切ITS扩增产物证明中国禾谷胞囊线虫ITS属于"B型",而摩洛哥禾谷胞囊线虫ITS属于"A型"。用HinfI酶切后,7个中国禾谷胞囊线虫群体产生2个RFLP片段(860和200 bp),而摩洛哥群体产生3个RFLP片段(520、340和200 bp),HinfI揭示出中国与摩洛哥禾谷胞囊线虫ITS之间存在差异。AvaI和HindⅢ不能酶切禾谷胞囊线虫ITS。用CfoI、Bsh1236I、MsrFI、ScrFI、HaeⅢ和MvaI 6种RE酶切中国和摩洛哥禾谷胞囊线虫群体的rDNA-ITS,均分别得到相同类型的RFLP分布型,因此这6种RE不能揭示中国与摩洛哥群体的rDNA-ITS的差异。     

河南郑州小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)的核糖体基因ITS序列和RFLP分析

 采用PCR技术对河南郑州禾谷孢囊线虫群体的核糖体基因(ribosomal DNA,rDNA)内转录间隔区(Internal Transcribed Spacers,ITS)进行扩增,获得片段长度约为1040bp。利用UPGMA方法分析了河南郑州禾谷孢囊线虫群体与近缘种的系统发育关系,结果表明:中国Heterodera avenae群体,H.australis和H.pratensis亲缘关系很近。8种限制性内切酶(Restriction Enzyme,RE)酶切禾谷孢囊线虫ITS的扩增产物,其中HindⅢ、AvaⅠ不能酶切PCR产物;Alu Ⅰ酶切PCR产物,获得560bp和480bp2个片段;RsaⅠ和Hinf Ⅱ酶切后分别得到3个片段(700、320、20bp和820、180、40bp);CfoⅠ是3个酶切位点(740、150、110、40bp);HaeⅢ和MvaⅠ能分别清晰地观察到3个片段(420、350、180bp和400、340、280bp),但有微小片段无法清晰观察到。9个种群所得RFLP图谱一致,说明郑州禾谷孢囊线虫群体可能是同一种群且不同于欧洲群体(typeA)和印度群体(typeB)的C型。     

甘肃小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3区序列特征及HS-RFLP分析

禾谷孢囊线虫是危害禾谷类作物的重要病原,严重威胁我国小麦主产区的小麦产量和品质.利用通用引物对甘肃、河南、安徽禾谷孢囊线虫群体28S rDNA-D2/D3区和rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列测定,利用UPG-MA方法分析了甘肃省7个种群、河南1个种群、安徽1个种群的禾谷孢囊线虫群体D2/D3区和ITS区的系统发育关系;用9种限制性内切酶对7个甘肃禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区进行了RFLP分析.结果表明:中国甘肃的禾谷孢囊线虫rDNA-D2/D3区片段长度约为780 bp,rDNA-ITS片段长度约为1 040 bp.7个甘肃禾谷孢囊线虫群体、1个河南安阳群体、1个安徽蚌埠群体的D2/D3区和新西兰的H.aucklandica群体亲缘关系很近;其ITS区同澳大利亚的H.australis、北京通州的H.avenae(AY148382)的亲缘关系很接近.RFLP分析表明,9种限制性内切酶酶切禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS共产生了22个酶切片段,不同酶切的RFLP分布型在7个种群间没有差异.甘肃省禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区具有高度的保守性,与中国的C型群体相近,但不同于欧洲的A型群体和印度的B型群体.这是首次报道甘肃CCN种群分子特征.     

甘肃小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3区序列特征及ITS-RFLP分析

禾谷孢囊线虫是危害禾谷类作物的重要病原,严重威胁我国小麦主产区的小麦产量和品质。利用通用引物对甘肃、河南、安徽禾谷孢囊线虫群体28SrDNA-D2/D3区和rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列测定,利用UPG-MA方法分析了甘肃省7个种群、河南1个种群、安徽1个种群的禾谷孢囊线虫群体D2/D3区和ITS区的系统发育关系;用9种限制性内切酶对7个甘肃禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区进行了RFLP分析。结果表明:中国甘肃的禾谷孢囊线虫rDNA-D2/D3区片段长度约为780bp,rDNA-ITS片段长度约为1040bp。7个甘肃禾谷孢囊线虫群体、1个河南安阳群体、1个安徽蚌埠群体的D2/D3区和新西兰的H.aucklandica群体亲缘关系很近;其ITS区同澳大利亚的H.australis、北京通州的H.avenae(AY148382)的亲缘关系很接近。RFLP分析表明,9种限制性内切酶酶切禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS共产生了22个酶切片段,不同酶切的RFLP分布型在7个种群间没有差异。甘肃省禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区具有高度的保守性,与中国的C型群体相近,但不同于欧洲的A型群体和印度的B型群体。这是首次报道甘肃CCN种群分子特征。     

根结线虫种群的线粒体DNA分析

 在同工酶和形态学鉴定的基础上,利用引物#C2F3和#1108对42个根结线虫种群线粒体DNA (mtDNA)中的COⅡ和LrRNA间区域进行特异性PCR扩增,35个种群的扩增产物约为1.7kb,其中29个是南方根结线虫,6个是爪哇根结线虫;3个花生根结线虫种群的扩增产物约为1.1kb;1个种群的扩增产物约为0.7kb,为根结线虫属在中国的新记录种;3个北方根结线虫种群的扩增产物约为0.5kb。用单条2龄幼虫提取物作模板得到的结果与大量提取DNA作模板的结果相同。为了区分产生相同大小片段的南方根结线虫和爪哇根结线虫,用限制性内切酶HinfⅠ对扩增产物进行酶切,结果表明:所有供试的南方根结线虫都可以被HinfⅠ酶切,且产生约1.3和0.4kb的2个限制性片段;但供试的爪哇根结线虫种群不能被酶切。由此表明,利用mtDNA PCR及酶切实验可以作为快速而准确地鉴定常见根结线虫的方法。     

马铃薯腐烂茎线虫特异性分子检测技术研究

 本研究利用通用引物(rDNA1/rDNA2)研究了21个国内甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)群体和1个韩国马铃薯茎线虫(D.destructor)群体的rDNA-ITS序列,从21个国内群体中扩增出2个大小不同的ITS片段,分别约为940bp和1100bp;经克隆、序列测定和分析比对发现其ITS区存在特异性差异,分别命名为A型和B型,其中18个群体DdTH、DdCL、DdJN、DdMY1、DdYX1、DdZZ、DdLN,DdDX1、DdFN,DdYX2、DDSX1、DdDX2、DdXY,DdLL、DdSX2、DdLY,DdMY2和DdPY的ITS扩增产物约为940bp,称之为A型马铃薯腐烂茎线虫(940bp),3个群体DdSH,DdTS,DdYS为B型马铃薯腐烂茎线虫(1100bp)。设计构建并筛选出A型和B型马铃薯腐烂茎线虫2对特异性引物DdS1/DdS2和DdL1/DdL2,分别扩增出A型马铃薯腐烂茎线虫、B型马铃薯腐烂茎线虫群体的特异片段252bp和485bp;引入D3A/D3B作为内标,设计出一步双重PCR检测技术;同时优化了检测体系和PCR反应程序。该技术具有较高的特异性和灵敏性,能快速、准确地检测出不同型的马铃薯腐烂茎线虫群体。     

陕西省小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS区序列与RFLP分析

 采用线虫通用引物TW81和AB28对采自陕西的20个小麦禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区进行PCR扩增、克隆和测序。利用Mega软件的UPGMA方法分析了陕西省小麦禾谷孢囊线虫群体及其与GenBank公布的近缘种的系统发育关系,结果表明陕西省小麦孢囊线虫群体的rDNA-ITS区片段的长度为1 045 bp,且均为禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）,ITS区序列同源性为99.56%,只有3处碱基存在差异。其ITS区同中国河南（EU106175）、北京（AY148382）、山东（HM370427）的禾谷孢囊线虫H. avenae,澳大利亚的H. australis（AY148395）及俄罗斯的H. pratensis（AY148351）的亲缘关系最为接近。利用8种限制性内切酶Ava Ⅰ（Eco88 Ⅰ）、Alu Ⅰ、Hha Ⅰ（Cfo Ⅰ）、Hae Ⅲ（BsuR Ⅰ）、Hind Ⅲ、Hinf Ⅰ、Rsa Ⅰ和Mva Ⅰ（Bst N1）对20个陕西省CCN群体的ITS区PCR扩增产物进行限制性内切酶谱（RFLP）分析,结果表明8种限制性内切酶酶切ITS-PCR产物后共产生22个酶切片段,20个种群的PCR-RFLP谱型一致,表明陕西省小麦禾谷孢囊线虫是同一个群体且与已报道的中国CCN群体的“C”型一致,有别于欧洲的“A”型群体和印度的“B”型群体。这是首次报道陕西省小麦禾谷孢囊线虫种群的分子特征。     

甘薯茎线虫rDNA-ITS1区的PCR扩增与序列分析

 利用PCR技术获得了甘薯茎线虫rDNA-ITS1区序列。序列分析表明,采自我国河北、山东、安徽的甘薯茎线虫16个地理种群的ITS1区序列分化为短型(S)和长型(L)2种基因型。山东费县芍药山乡4个地理种群为L型,ITS1区长度为466 bp;河北、安徽和山东费县新庄乡的12个地理种群为S型,ITS1区长度为288 bp。甘薯茎线虫与鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)的rDNA-ITS1序列同源性为52.0%~52.5%,与腐烂茎线虫(D.destructor)序列同源性为82.0%~85.4%;我国甘薯茎线虫不同地理种群间的序列同源性为96.6%~100.0%。     

拟悬铃木根结线虫及其相似种的rDNA-ITS-RFLP分析

本文用特异性引物F195和V5367,对拟悬铃木根结线虫和花生根结线虫的核糖体DNA内转录间隔区（rDNA-ITS）进行了PCR扩增,扩增产物用5种限制性内切酶Taq Ⅰ、Rsa Ⅰ、Msp Ⅰ、Cla Ⅰ、HaeⅢ进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析.Taq Ⅰ、Rsa Ⅰ、Msp Ⅰ、Cla Ⅰ酶切拟悬铃木根结线虫的rDNA-ITS扩增产物所获得限制性酶谱与花生根结线虫的限制性酶谱一致,只有HaeⅢ酶切拟悬铃木根结线虫和花生根结线虫的rDNA-ITS产物所得酶谱不同.rDNA-ITS扩增产物的HaeⅢ酶切图谱可以区分拟悬铃木根结线虫和花生根结线虫.     

ITS—RFLP分析进行昆虫病原线虫斯氏属和异小杆属的分类鉴定

本研究通过PCR扩增和六种限制性内切酶（AluⅠ，HinfⅠ，MboⅠ，RsaⅠ，HaeⅢ和PvuⅡ）酶切，对国内害虫防治上常用的几种昆虫病原线虫，包括斯氏属S.car-pocapsae,S.feltiae和S.glaseri以及异小杆属H.bacteriophora,H.zealandica,H.indicus和H.megidis等8个品系rDNA-ITS进行分析。建立起可以区分各线虫种的标准RFLP图谱。该方法快速简便，稳定可靠，需要的样品量少。可以用于新鲜的，或冻存的样品，甚至分析单条的线虫，不仅可进行昆虫病原线虫的快速分类鉴定。而且进一步可以应用于线虫田间释放的辅助监测。实际田间感染率的测定和线虫毒力的比较。     

马铃薯腐烂茎线虫RPA-LFD可视化快速检测方法的建立

 马铃薯腐烂茎线虫是为害我国甘薯和马铃薯的一种重要植物病原线虫,也是我国重要的检疫性有害生物。为实现对该线虫的准确、快速且可视化的检测,本研究以马铃薯腐烂茎线虫rDNA-ITS序列为靶标构建了重组酶聚合酶结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)的可视化快速检测体系。该体系可在39 ℃条件下15 min内特异性地完成对马铃薯腐烂茎线虫的检测,对A型(甘薯种群)和B型(马铃薯种群)单头线虫(J4)的检出底限均为3 125^-1头线虫,可以直接对土壤和甘薯茎中的马铃薯腐烂茎线虫进行检测,灵敏度可达1头(J4)/10 g土壤和1头(J4)/2 g甘薯茎组织。该体系操作简便、成本低廉、结果可视,可为马铃薯腐烂茎线虫的早期预警和口岸检疫提供技术支撑。     

两种亚菊属植物挥发油及其主要成分对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性

为探究植物挥发油对马铃薯腐烂茎线虫的防治效果，本研究用丝裂亚菊和光苞亚菊挥发油及其主要组分对该线虫进行触杀毒杀活性的测试。采用药物浸泡法，将提取的两种植物挥发油及其主要的共有组分桉叶油醇和马鞭草烯醇作用于马铃薯腐烂茎线虫，测试致死中浓度，进而将桉叶油醇和马鞭草烯醇按不同比例进行复配混合，测试两者复配后的杀线虫活性，结果显示：处理24 h后，丝裂亚菊和光苞亚菊的挥发油均对马铃薯腐烂茎线虫有一定的触杀毒杀活性，致死中浓度（LC_{50/24 h}）分别为1.50 mg/mL和1.23 mg/mL；处理48 h后，丝裂亚菊和光苞亚菊的挥发油对马铃薯腐烂茎线虫的致死中浓度（LC_{50/48 h}）分别为1.06 mg/mL和0.70 mg/mL，较处理24 h后杀虫作用更显著。处理24 h后，桉叶油醇（LC₅₀＝0.49 mg/ml）与马鞭草烯醇（LC₅₀＝1.09 mg/mL）的杀线虫活性强于两种亚菊属植物挥发油；桉叶油醇和马鞭草烯醇以2：6、4：4和3：5的体积比混配后，其LC₅₀（0.18、0.17和0.20 mg/mL）都明显比两种化合物单独处理时要低，说明这两种化合物在挥发油中发挥了协同杀线虫的作用，且效果明显。本研究可为亚菊属植物挥发油及其主要组分绿色防控马铃薯腐烂茎线虫奠定基础。     

水稻拟禾本科根结线虫生防细菌的分离鉴定与防治效果评价

为获得对水稻拟禾本科根结线虫具有较高杀线虫活性的生防细菌,初筛以马铃薯腐烂茎线虫、复筛以拟禾本科根结线虫2龄幼虫为靶标线虫,采用直接触杀法对土壤分离细菌进行筛选。获得8株具有较高杀线虫活性的菌株,其中D45菌株发酵液的杀虫活性最好。其发酵液上清5倍稀释液处理24、48 h后,马铃薯腐烂茎线虫和拟禾本科根结线虫2龄幼虫的死亡率分别为69.8%、72.1%和60.9%、70.4%。盆栽试验和田间试验表明,在拟禾本科根结线虫侵染前采用D45菌株发酵液进行土壤处理,可显著减少水稻根结数。D45高活性菌株产生的杀线虫物质对蛋白酶稳定,但不耐热和酸。经生理生化测定结合16S rRNA基因序列分析,D45菌株为巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium。D45菌株对防治水稻拟禾本科根结线虫具有应用潜力。     

马铃薯腐烂茎线虫28S rDNA-D2/D3区序列分析

 我国危害甘薯的马铃薯腐烂茎线虫rDNA-ITS基因片段长度存在A型(900bp)和B型(1100bp)2个类型,A型腐烂茎线虫群体的ITS片段比B型群体少200bp。为了进一步研究这2种类型群体的发育关系,本文用线虫通用引物D2A和D3B对来自国内的21个马铃薯腐烂茎线虫群体和1个韩国的马铃薯腐烂茎线虫28SrDNA-D2/D3区进行了PCR扩增,均产生大小一致的片段,长度约为780bp,克隆、测序后用DNAMAN5.2软件和MEGA4软件进行分析比对,结果表明我国21个马铃薯腐烂茎线虫群体28SrDNA-D2/D3区只有20余个碱基的差异,相似率达97.2%。基于UPGMA构建的系统发育树很好地区分了马铃薯腐烂茎线虫A型和B型群体,展现出了群体的来源及发育关系。     

4种短体线虫形态及rDNA-ITS的PCR-RFLP鉴定

 短体线虫隶属于垫刃目(Tylenchida Thorne, 1949),垫刃亚目(Tylenchina Chitwood, 1950),短体科(Pratylenchidae Thorne, 1949),短体亚科(Pratylenchinae Thorne, 1949),短体线虫属(Pratylenchus Filipjev, 1936),是一类重要的迁移性内寄生植物病原线虫 ^[1]。国内外已报道该属线虫百余种。其中我国已报道种类有P.alleni、 P.artemisiae、 P.coffeae、 P.crenatu、 P.cruciferus、 P.dioscoreae、 P.hexincisus、 P.loosi、 P.penetrans、 P.pratensi、 P.neglectus、 P.penetrans、 P.scribneri、 P.thornei、 P.varicaudatus、 P.vulnus及P.zeae 17种。近年来,随着世界各地贸易往来日益频繁,植物线虫的传播机会大大增加,我国口岸也先后从进境植物根围截获P.brachyurus、 P.neglectus、 P.zeae、 P.coffeae、 P.penetrans、 P.pinguicaudatus等。基于本类群线虫的重要性和国内以往的鉴定都主要单纯依据形态学特征,本研究结合形态学和rDNA的PCR-RFLP及序列分析技术对浙江和海南不同寄主上植物线虫调查时发现的4个短体线虫群体进行了鉴定。     

甘薯对马铃薯腐烂茎线虫趋化性的影响

由马铃薯腐烂茎线虫侵染造成的甘薯茎线虫病是一种严重影响甘薯产量和品质的病害。线虫向寄主根部移动及取食危害可能是受寄主释放的化感信息物质控制。为最终明确甘薯中对线虫具有高效引诱能力的物质,本研究利用水琼脂平板法测试了甘薯不同品种与不同组织对线虫的引诱作用。结果表明不同品种甘薯薯块和薯茎对马铃薯腐烂茎线虫引诱能力具有一定差异,感线虫品种栗子香的薯块对线虫的引诱率要高于其他测试品种。随着薯块/薯茎在水琼脂平板上放置时间延长,其吸引线虫的效果增加,96 h后引诱率达到20%。同一品种甘薯茎的引诱能力显著高于薯块、薯叶。甘薯中所含对线虫具引诱作用的活性物质对热稳定,80℃加热8 h后薯茎对线虫引诱率与新鲜茎相比无显著差异,为4.5%。甘薯茎经过不同有机溶剂分别萃取后,乙醇萃取物对线虫的引诱率为6.7%,显著高于其他萃取物。本文初步明确了甘薯中所含线虫趋化物的性质,为其开发应用奠定了基础。