海南岛吊罗山杀棉铃虫Bt菌株的筛选

【目的】从海南岛吊罗山原始热带雨林区筛选分离杀棉铃虫Bt菌株,为研发新的防治棉铃虫的生物农药和抗虫转基因棉花奠定基础。【方法】在吊罗山原始热带雨林区不同海拔高度采集253份土壤样品,采用醋酸钠高温处理方法从中分离各类芽孢杆菌,通过显微镜观察鉴定出产伴胞晶体蛋白的苏云金芽孢杆菌(Bt),对伴胞晶体蛋白进行SDS-PAGE电泳和质谱分析,了解其基本特性。并以棉铃虫二龄幼虫为靶标,测定获得的Bt菌株对棉铃虫的杀虫活性。【结果】从253份土壤样品中分离出芽孢杆菌786株,其中产伴胞晶体蛋白的Bt菌株33株,Bt菌株分离率为4.2%。SDS-PAGE电泳和质谱分析表明,分离Bt菌株含有的伴胞晶体蛋白与已发现的毒素蛋白不同,可能为新型晶体蛋白;利用棉铃虫二龄幼虫进行Bt分离株生物活性测定,结果表明有8株Bt菌株对棉铃虫幼虫的致死率为25%~85%。【结论】从海南岛吊罗山原始热带雨林区筛选分离获得8株杀棉铃虫的Bt菌株,这些菌种可能含有新的杀虫晶体蛋白基因。     

苏云金芽孢杆菌及vip基因在不同自然环境中分布情况的比较

营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein,简称VIP)是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在营养期表达的一类新型杀虫毒蛋白,该蛋白的发现使得Bt杀虫剂在杀虫活性、杀虫范围方面得到很大突破。首次比较我国不同气候类型(热带:海南省,亚热带:广西壮族自治区,温带:黑龙江省)的Bt菌株和vip基因的分布情况。结果表明,从海南省841份土样中分离出156株Bt菌(18.55%),从广西地区1 420份土样中分离出356株Bt菌(25.07%),从黑龙江省1 010份土样中分离出167株Bt菌(16.53%);从海南省的156株Bt菌中鉴定出22个vip基因(占14.1%),从广西地区的356株Bt菌中鉴定出2个vip基因(占5.62%),然而,从黑龙江省的156株Bt菌中没有鉴定出vip基因(0%)。利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,简称PCR)方法成功克隆出1个vip3Aa的全长基因并获得登录号KT792883,将该基因插入到表达载体p ET-21b中,转化菌株Rosetta(DE3),在低温条件下表达88 ku的蛋白,将该蛋白进行生物活性测定,结果显示,该蛋白对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)具有较好的杀虫活性,LC50为5.124 ng/mg,对棉铃虫(Heliothis armigera)活性较低,LC50为870.1 ng/mg。研究结果显示,Bt菌株和vip基因的分布有地域性差异,在温度较高的热带、亚热带地区有比较丰富的Bt菌株和vip基因资源。研究将有利于充分利用土壤中的Bt菌株,分离具有自主知识产权和重要应用价值的新型vip抗虫基因,这将会为研究新型杀虫蛋白、延缓害虫抗性问题提供有益帮助。     

Bt杀虫蛋白对甜菜夜蛾生长发育的影响

 实验室内研究了Bt杀虫蛋白对甜菜夜蛾生长发育的影响。结果表明：甜菜夜蛾二龄幼虫取食含Bt杀虫蛋白浓度为0.5μg/g,1.0μg/g,2.0μg/g,4.0μg/g,8.0μg/g的人工饲料后,随着饲料中杀虫蛋白浓度增加,幼虫死亡率增加、幼虫发育历期延长、蛹的发育历期缩短、蛹重变轻、化蛹率降低。甜菜夜蛾四龄幼虫取食含Bt杀虫蛋白浓度为2.0μg/g,4.0μg/g,8.0μg/g,16.0μg/g的人工饲料后,幼虫死亡率、化蛹率、蛹的羽化率均无明显差异;而幼虫发育历期延长、蛹的发育历期缩短,蛹重减轻。杀虫蛋白浓度为8.0μg/g,16.0μg/g时,幼虫发育历期明显长于对照。杀虫蛋白浓度为16.0μg/g时, 蛹的发育历期和蛹重与对照差异显著     

华北地区棉铃虫与转Bt杀虫蛋白基因棉花间的互作研究

转Bt杀虫蛋白基因棉花（Bt棉）对棉铃虫杀虫活性存在明显的时间差异和器官间的差异。其杀虫活性在华北地区的第二代棉铃虫发生期较高,而在第三、四代发生期明显降低。在不同器官之间,花的杀虫效果最低。棉铃虫初孵幼虫从Bt棉的花上开始取食,存活幼虫可继续取食棉铃,其相对化蛹率达28.1%,并能正常羽化,致使Bt棉在田间对第三、四代棉铃虫起到抗性汰选作用。棉铃虫幼虫在室内经Bt棉汰选17代,平均每代的汰选强度为67.2%,对Cry1A型Bt杀虫蛋白的抗性指数增至7.1倍,导致Bt棉对汰选种群的抗虫等级由高抗级降低为中抗级。根据试验结果讨论了我国Bt棉的抗性预防和治理对策。     

一株苏云金芽胞杆菌新菌株的基因型及其杀虫活性

苏云金芽胞杆菌Bt WL-1是本实验室自行分离得到的对鳞翅目多种害虫都具有较高活性的野生菌株。本研究利用扫描电镜观察发现,该菌株产生菱形伴孢晶体蛋白,该晶体蛋白对鳞翅目棉铃虫、二点委夜蛾、小菜蛾和小地老虎等2龄幼虫都具有较高的毒力。利用Bt基因通用引物PCR扩增得到该菌株含有cry1基因,8%SDS-PAGE检测得到该菌株只含有分子量为130kDa的蛋白主带。质谱分析表明,该蛋白主带和Bt Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1Ea、Cry1Ae、Cry1Db和Cry1Aa蛋白具有较高的同源性。     

表达CpTI或CpTI+Bt基因水稻对二化螟的杀虫活性

明恢86是目前我国应用最为广泛的优良籼稻恢复系,明恢86CpTI和明恢86CpTI+Bt分别为表达豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因(单基因)和CpTI+Bt蛋白基因(双基因)的明恢86.以明恢86为对照,系统测定了明恢86CpTI和明恢86CpTI+Bt对二化螟的杀虫活性.结果表明,明恢86CpTI和明恢86CpTI+Bt对二化螟都表现出很强的杀虫活性.取食分孽期明恢86CpTI和明恢86CpTI+Bt7d后,二化螟1龄幼虫的校正死亡率高达88.6%和92.1%,对二化螟均表现高抗.该转基因水稻还对存活二化螟幼虫的生长发育产生了明显的影响,取食明恢86、明恢86CpTI和明恢86CpTI+Bt后存活的二化螟幼虫历期分别为(36±1.9)、(47±2.9)和(46±2.0)d,饲喂该转基因水稻后二化螟的幼虫历期明显延长.此外,二化螟老熟幼虫取食该转基因水稻后,鲜重平均减少了8-11mg,蛹重明显减轻,繁殖能力明显下降.     

一株对鳞翅目蔬菜害虫具有广谱高毒力的新Bt菌株

从河北省土壤分离出苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）MB-15菌株,利用室内生物活性测定的方法,与Bt标准菌株HD-1的杀虫毒力进行比较,结果发现该菌株胞晶混合液对棉铃虫(Helicoverpa armigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、小菜蛾(Plutella xylostella)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)和菜青虫(Pieris rapae)等5种鳞翅目蔬菜害虫的毒力均高于标准菌株Bt HD-1胞晶混合液。对发酵液各组分活性的分析发现,该菌株的上清液对胞晶混合物的杀虫活性有明显的增效作用。光学显微镜下观察该菌株伴胞晶体为菱形,SDS-PAGE分析显示其伴胞晶体主要由130.0 kDa和65.0 kDa 两种晶体蛋白组成。利用PCR-RFLP对其杀虫基因型进行鉴定,结果表明该菌株含有cry1Ac、cry2Aa、cry1I和vip3Aa基因。推断该菌株是一株对鳞翅目蔬菜害虫的防治具有潜在的商业开发价值的Bt野生株。     

上海地区苏云金芽孢杆菌的分离及其对草地贪夜蛾室内杀虫活性的测定

为进一步发掘国内苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)的菌株资源,在上海市若干地区搜集土壤样品,采用Na Ac-抗生素筛选法从土样中分离野生Bt菌株,通过光学显微镜染色镜检、PCR-RFLP体系及SDS-PAGE电泳等方法对分离菌株的杀虫晶体蛋白形态、蛋白表达量及cry基因类型进行分析,并测定了分离菌株对草地贪夜蛾的室内杀虫活性。结果表明:在上海地区采集的165份土壤样品中共分离得到苏云金芽孢杆菌50株,总出菌率为8.20%;其伴孢晶体蛋白呈菱形、球形、椭球形、不规则形等晶体形态,以球形晶体为主;多数表达130 ku、90 ku、80 ku、50 ku蛋白;分离菌株所含cry基因类型丰富,包含cry1、cry3、cry8类等共16种基因类型,以cry32及cry8类基因居多;有6株菌株对草地贪夜蛾表现出高杀虫活性,72 h校正死亡率最高可达100%。上述分离菌株对后续开展草地贪夜蛾的绿色防控及抗性治理具有重要的实践意义。     

一株对鳞翅目蔬菜害虫具有广谱高毒力的新Bt菌株

从河北省土壤分离出苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)MB-15菌株,利用室内生物活性测定的方法,与Bt标准菌株HD-1的杀虫毒力进行比较,结果发现该菌株胞晶混合液对棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、小菜蛾(Plutella xylostella)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)和菜青虫(Pieris rapae)等5种鳞翅目蔬菜害虫的毒力均高于标准菌株Bt HD-1胞晶混合液。对发酵液各组分活性的分析发现,该菌株的上清液对胞晶混合物的杀虫活性有明显的增效作用。光学显微镜下观察该菌株伴胞晶体为菱形,SDS-PAGE分析显示其伴胞晶体主要由130.0 kDa和65.0 kDa两种晶体蛋白组成。利用PCR-RFLP对其杀虫基因型进行鉴定,结果表明该菌株含有cry1Ac、cry2Aa、cry1I和vip3Aa基因。推断该菌株是一株对鳞翅目蔬菜害虫的防治具有潜在的商业开发价值的Bt野生株。     

11种农药对芦笋地甜菜夜蛾的室内杀虫活性

为筛选适合芦笋地甜菜夜蛾防控使用的低毒、高效杀虫剂,开展11种杀虫剂对甜菜夜蛾3～4龄幼虫的室内杀虫活性测定。结果表明,虫螨腈、乙基多杀菌素和氯虫苯甲酰胺稀释1 000倍液对甜菜夜蛾具有良好的杀虫活性,且速效性好。虱螨脲1 000倍、茚虫威2 000倍杀虫活性次之,药后5 d 死亡率也在95%以上。甜菜夜蛾核型多角体病毒1 000倍和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐4 000倍均速效性不强,药后5 d 对幼虫的致死率分别为85%和775%。苦参碱600倍、多杀霉素1 000倍、氟啶脲600倍、印楝素500倍对甜菜夜蛾的杀虫活性不高。     

甘蓝夜蛾核型多角体病毒对主要夜蛾科害虫生物活性的测定

文章测定甘蓝夜蛾核型多角体病毒(Mabr NPV)对农业生产中5种主要夜蛾科害虫幼虫的毒力。结果表明,MabrNPV对斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫、粘虫、小地老虎幼虫均有致病性,但致病力存在差异,其对五种夜蛾科害虫2龄幼虫致死中浓度LC_(50)分别为1.19×10~5、2.02×10~5、4.30×10~5、2.15×10~6、1.29×10~(16)PIB·mL~(-1),MabrNPV对斜纹夜蛾和甜菜夜蛾毒力最高,对小地老虎毒力最低,对斜纹夜蛾和甜菜夜蛾与其他3种夜蛾毒力差异显著。对斜纹夜蛾和甜菜夜蛾幼虫毒力随虫龄增加而降低,幼虫对病毒易感性随虫龄增加而下降。在同一饲毒浓度下,MabrNPV对斜纹夜蛾和甜菜夜蛾幼虫致死中时间LT_(50)随虫龄增加而升高;同一虫龄下,LT_(50)随MabrNPV浓度增加而减少。     

Geographical Distribution of Bacillus thuringiensis Strains and vip3 Genes in Different Climatic Zones in China

Vegetative Insecticidal Proteins(VIPs),a large family of insecticidal proteins,are produced from Bacillus thuringiensis (Bt) during the vegetative growth stage. VIPs represent the second generation of bio-insecticides that confer a wider insecticidal spectrum and have stronger activity.This work compared the geographical distribution of Bt strains and their vip3 genes in different climatic zones in China, the tropical (Hainan Province), subtropical (Guangxi Province) and temperate zones (Heilongjiang Province). A total of 156 Bt strains were isolated from 841 soil samples in Hainan Province tropical region, 356 Bt strains from 1 420 soil samples in Guangxi Province and 167 Bt strains from 1 010 soil samples in different geographical regions in Heilongjiang Province. Twenty-two out of 156 strains from tropical Hainan Province and two out of 356 from subtropical Guangxi Province were found to express vip3 genes,while vip3 genes were not expressed from temperate zone in Heilongjiang Province.Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)was used to identify different types of vip 3 genes that were within the same family and three full-length vip3 genes were isolated.The genes cloned from Bacillus thuringiensis strain SL3 expressed in the transformed E.coli BL21 strain. Through SDS-PAGE, 88.6 ku insecticidal protein was expressed. The bioassays used two-instar larva of Lepidoptera insects (Spodoptera exigua and Agrotis ipsilon)were performed.The results of the bioassays showed that the protein strongly inhibited the body weight increasement on Spodoptera exigua and Agrotis ipsilon in a standard bioassay.Taken together,the results indicated that the distribution of Bt strains and vip3 genes had regional preference.Tropical and subtropical regions were the rich resources of Bt strains and vip3 genes compared with temperate region.These results would undoubtedly facilitate the studies of insecticidal proteins and expand the list of the pest-killing candidates to make fully use of the extremely rich microbial resources.The new vip 3 genes isolated in the current study might also help resolve the emerging insecticidal resistance problems.     

不同植食性昆虫危害棉花后棉株5种防御基因表达变化

 【目的】了解棉花体内5种防御蛋白基因在棉花防御植食性害虫中的作用。【方法】使用定量PCR分别测定棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾危害和机械损伤0（未处理的对照）、6、12、24、48、60 h后,多酚氧化酶（PPO）、叶绿体铜/锌超氧化物歧化酶、ATP合酶β亚基、捕光蛋白复合物Ⅱ、热激蛋白（Hsp70）等5种棉花防御蛋白基因表达量的变化。【结果】在4种危害处理试验中,多酚氧化酶、热激蛋白和叶绿体铜/锌超氧化物歧化酶对昆虫的取食危害应答较强,捕光蛋白复合物Ⅱ对机械损伤的应答较强,ATP合酶β亚基对昆虫的取食危害和机械损伤应答都较强。PPO对棉铃虫危害应答较快,对甜菜夜蛾危害的应答反应较为迟钝,对斜纹夜蛾的危害没有特异的应答。经过上述4种处理,棉花体内Hsp70表达量都有明显的反应,对棉铃虫和甜菜夜蛾危害反应上调较大。ATP合酶β亚基在受到对机械损伤和斜纹夜蛾危害后表达量下调,而在受到棉铃虫和甜菜夜蛾危害后表达量上调。捕光蛋白复合物Ⅱ在受到对机械损伤、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾危害后表达量下调,而在受到棉铃虫危害后表达量上调。叶绿体铜/锌超氧化物歧化酶在受到对机械损伤和斜纹夜蛾危害后表达量下调,而在受到棉铃虫和甜菜夜蛾危害后表达量上调,该基因对斜纹夜蛾危害的应答较强,对甜菜夜蛾危害特异性应答较弱。【结论】棉花对于不同昆虫的危害所产生的应答响应不同,具有一定的专一性。     

cry1Ac基因启动子表达Vip3Aa蛋白特性分析

苏云金芽胞杆菌cry基因启动子常用于构建蛋白表达载体。为探讨苏云金芽胞杆菌cry基因启动子指导Vip3Aa蛋白表达情况及杀虫活性,以p UC19载体为基础,运用重叠引物PCR方法构建Vip3Aa11表达载体,并与由T7启动子指导的Vip3Aa11表达蛋白杀虫活性、抗胰蛋白酶稳定性比较,初步探索发酵条件。结果表明,cry1Ac启动子与T7启动子均在上清液中表达大小为88 ku Vip3Aa11蛋白,对甜菜夜蛾、棉铃虫杀虫活性差异不显著,cry1Ac基因启动子在37℃、48 h更适合Vip3Aa11蛋白的表达,为vip基因表达、功能验证及杀虫机理等研究提供新思路。     

Comparative Analysis of Bacillus thuringiensis Vip3Aa57 and Vip3Aa62 Insecticidal Activities

Bacillus thuringiensis (Bt) exhibits strong insecticidal activity and is harmless to non-target organisms such as human and animals. Bt becomes the most commonly used environment-friendly insecticidal microorganism. However, the insecticidal activities of different Bt strains variy significantly. Therefore, it is particularly important to compare the insecticidal activities of different strains and explore their insecticidal effector mechanisms to expand Bt insecticidal spectrum and enrich transgenic resources. Here, the insecticidal activities of Vip3Aa57 and Vip3Aa62 strains, carrying vegetative insecticidal protein-encoding genes that were inserted into the expression vector pET-21b and transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) strain, expressing 88 ku protein, were compared. Vip3Aa57 protein reportedly displayed body weight inhibition effect on Spodoptera exigua without affecting Heliothis armigera while Vip3Aa62 protein was known to have strong insecticidal activity against S. exigua (LC50=5.124 ng ? mg-1). A low H. armigera activity (LC50=870.1 ng ? mg-1) was observed. The paraffin sectioning results showed that Vip3Aa57 protein affected S. exigua midgut cell morphology. The laser confocal microscopic imaging results showed that Vip3Aa57 bound to receptors in the midgut without damaging the midgut tissue morphology. This study would be conducive for making full use of Bt strains in the soil to compare the insecticidal activities of different Vip insecticidal genes. It could thus provide significant help in revealing the underlying insecticidal mechanisms of Vip3Aa insecticidal genes, developing new insecticidal proteins and delaying pest resistance problems.     

苏云金杆菌新菌株WZ-7的PCR-RFLP分析及生物活性研究

利用PCR—RFLP技术分析了自河北省土壤中分离的苏云金杆菌新菌株WZ-7，结果表明该菌株含有cryl、cry2Ab、cryllal型基因，其中cryl型基因的酶切片段类型不同于已发表的基因类型，有可能含有新的基因。SDS—PAGE分析结果出现130、79、73、66、60、58kD左右的6种晶体蛋白，毒素蛋白类型属于Ⅱ型。室内生测结果显示，该菌株对重要的农业害虫棉铃虫、甜菜夜蛾、小菜蛾、菜青虫、玉米螟等均有较高的杀虫毒力。     

利用替代寄主增殖SfaMNPV的研究

利用替代寄主棉铃虫增殖SfaMNPV时 ,不同的接种浓度、虫龄及饲养温度对棉铃虫增殖病毒都有一定的影响。用 1× 1 0 7PIB/ml接种浓度感染三龄幼虫 ,幼虫饲养温度为 2 5℃时 ,获得的病毒产量最高 ,为每克虫尸含多角体 78.34亿。     

虫酰肼对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用

【目的】研究证实虫酰肼是否对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)酚氧化酶活性具有抑制作用。【方法】采用生物化学方法,分别测定虫酰肼对甜菜夜蛾5龄幼虫离体酚氧化酶的作用特点和用虫酰肼浸泡饲料饲喂5龄幼虫后,虫酰肼对幼虫头部、血淋巴及表皮组织酚氧化酶活性的抑制作用。【结果】随着虫酰肼浓度增大,酚氧化酶活力呈逐渐下降趋势,虫酰肼对酚氧化酶的抑制中浓度(IC50)为5.43μmol·L-1。虫酰肼对酚氧化酶的抑制作用表现为混合型抑制,游离酶抑制常数(K i)和酶-底物络合物抑制常数(K is)分别为11.223μmol·L-1和34.036μmol·L-1。通过研究金属铜离子和酶液对虫酰肼吸收峰的影响,推测虫酰肼对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用不是与该酶活性中心的铜离子结合,而可能是与酚氧化酶蛋白结合发生作用有关。用28.41μmol·L-1和85.23μmol·L-1亚致死剂量浓度的虫酰肼分别处理甜菜夜蛾5龄幼虫24、48和72h后,测定其头部、血淋巴和表皮酚氧化酶的活性。结果表明,随着用虫酰肼处理时间延长,两个剂量的虫酰肼对幼虫头部、血淋巴和表皮酚氧化酶的抑制作用基本呈逐渐增大趋势;处理后相同时间,高剂量的虫酰肼对酚氧化酶活性的抑制率基本上高于低剂量的抑制率;虫酰肼对头部酚氧化酶的抑制率最高,血淋巴次之,表皮最低。【结论】虫酰肼对甜菜夜蛾酚氧化酶具有明显的抑制作用,幼虫新表皮形成过程受到阻碍可能与虫酰肼抑制酚氧化酶的活性有关。     

基于深度学习的蔬菜鳞翅目害虫自动识别与检测计数

鳞翅目害虫是蔬菜作物中最重要且常见的一类害虫。由于受到复杂田间背景,光照及害虫姿态等的影响,传统的害虫自动识别与检测计数方法准确率比较低。为实现在田间快速准确地对目标害虫进行自动识别和检测计数,分别提出了基于深度卷积神经网络的识别模型和检测计数模型。针对菜粉蝶、棉铃虫、甜菜夜蛾、小菜蛾、斜纹夜蛾这5种常见且容易混淆的蔬菜鳞翅目害虫,构建了分类识别数据集和检测计数数据集,并分别进行了实验,平均识别率达到94.5%,检测均值平均精度(mAP)达到76.6%,与传统方法相比,证明了此方法的优越性。实验结果表明,该方法对于蔬菜鳞翅目害虫的识别和检测计数是可行的,且达到了实际应用水平。