水牛PNPLA8基因编码区克隆、表达分析及催乳素对该基因的调节作用

为了探究磷脂酶patatin样域包含蛋白8（patatin-like phospholipase domain containing 8,PNPLA8）在水牛乳腺脂质代谢中的作用,试验根据GenBank中公布的奶牛PNPLA8基因序列（登录号：XM_005205444.4）设计引物,应用PCR扩增并克隆水牛PNPLA8基因编码区（CDS）,应用生物信息学软件分析序列及蛋白质结构;抽提水牛不同组织及不同泌乳期乳腺组织RNA,利用实时荧光定量PCR检测PNPLA8基因在不同组织间和不同泌乳期的表达;利用不同浓度的催乳素处理水牛乳腺上皮细胞,通过定量检测催乳素对PNPLA8基因表达的影响。结果显示,水牛PNPLA8基因CDS长2 355 bp,编码784个氨基酸,与牦牛、山羊等PNPLA8基因具有较高的同源性;PNPLA8基因在所检测的水牛11个组织中有不同水平的表达,在肺脏和乳腺中表达量相对较高,在脂肪和肌肉组织中表达量较低;在整个泌乳期内PNPLA8基因的表达呈现"低-高-低"趋势;催乳素处理水牛乳腺上皮细胞结果显示,随着催乳素浓度升高,PNPLA8基因表达量逐渐下降。本研究成功克隆了水牛PNPLA8基因,并发现PNPLA8基因是参与乳腺泌乳的一个功能基因,为进一步研究PNPLA8基因在水牛乳腺中的功能奠定基础。     

水牛泌乳期与非泌乳期乳腺组织miRNAs表达谱鉴定及差异表达分析

旨在鉴定分析水牛乳腺泌乳期和非泌乳期miRNA的表达谱和差异作用机制。采集水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织,利用Solexa测序技术构建2个时期miRNAs表达谱,鉴定前体miRNAs、成熟miRNAs和新miRNAs,分析miRNAs的第一偏好性核苷酸和染色体分布,发掘水牛泌乳期和非泌乳期高表达及差异表达miRNAs。结果显示,本研究构建了水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织2个miRNA表达谱,分别获得12 768 110和12 569 467条18~31nt的高质量序列。测序确认了归属259个miRNAs家族的359个成熟miRNAs和363个pre-miRNAs及5个水牛特有的miRNAs。U是19和25nt miRNAs的5′端最普遍的核苷酸。bbu-let-7b、bbu-let-7a、miR-26a和miR-21等miRNAs在2个时期均呈现高表达;bbu-miR-148a、143、200c、200a和bbu-let-7f等miRNAs在非泌乳期特异性高表达。bbu-miR-125b、29a和bbu-let-7c等miRNAs在泌乳期特异性高表达。bbu-miR-148a、143、200a、141和30a-5p等miRNAs在泌乳期的表达量下降为非泌乳期的1/2以下。而bbu-miR-26a、29a、125b、99a和bbulet-7c等miRNAs在泌乳期表达量大于或等于2倍非泌乳期丰度。本研究构建了水牛泌乳期以及非泌乳期乳腺组织2个miRNAs表达谱,测序确认了259个水牛miRNAs家族的359个成熟miRNAs和363个前体miRNAs,5个水牛特有miRNAs和10个高差异表达miRNAs,为进一步阐明奶水牛泌乳关键miRNAs作用机制奠定了基础。     

牦牛酪蛋白基因家族的克隆及组织表达分析

本研究旨在克隆牦牛酪蛋白基因家族(CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3)的CDS区序列,鉴定其在牦牛不同组织中的表达水平。选取4岁龄左右处于泌乳期的健康类乌齐母牦牛3头,屠宰后分别采集乳腺、心脏、肝脏、骨骼肌组织,分别提取组织总RNA并反转录为cDNA,设计酪蛋白基因家族特异性引物扩增酪蛋白基因家族序列,进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR法分别检测酪蛋白家族基因mRNA水平。结果显示,克隆得到CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3基因cDNA序列分别为919、832、805和715bp,其CDS区全长分别为645、669、690和585bp,分别编码214、222、259和194个氨基酸残基。类乌齐牦牛酪蛋白基因家族与黄牛亲缘关系最近,其次是印度水牛,而与单胃动物猪的亲缘关系最远。组织表达结果显示,酪蛋白基因家族在组织中广泛表达,其中在乳腺组织中的表达量最高,其次是骨骼肌组织。在乳腺组织中CSN1S1、CSN1S2、CSN2基因之间表达量差异不显著(P0.05),但CSN2基因表达量显著高于CSN3基因(P0.05)。以上结果为酪蛋白基因家族在牦牛乳腺蛋白质代谢调控机制的研究提供了参考依据。     

猪DNA甲基转移酶基因家族进化分析

【目的】 探究猪DNA甲基转移酶（DNMT）基因家族的基因特性及表达模式。【方法】 利用生物信息学方法鉴定猪全基因组范围的DNMT基因家族，并对其染色体定位、理化性质、蛋白质结构、亚细胞定位、基因结构、保守基序、系统进化关系、共线性关系和基因表达模式进行分析。【结果】 共鉴定得到5个猪DNMT基因家族成员：PigDNMT1、PigDNMT2、PigDNMT3、PigDNMT4和PigDNMT5，分别位于2、3、13、14、17号染色体上。猪DNMT基因家族进化树分析发现，PigDNMT1和PigDNMT4、PigDNMT2和PigDNMT5的亲缘关系较近。PigDNMT2和PigDNMT5具有相同数量和排列顺序的保守基序，但在基因结构上差异较大。系统进化树结果揭示，猪、人、小鼠和牛的DNMT基因家族分为4个亚族，其中猪与牛的DNMT基因家族亲缘关系更近。基因共线性分析显示，猪与人、小鼠、牛之间都具有4对直系同源DNMT基因，表明4个物种的DNMT基因间存在较强的共线性关系。猪DNMT家族蛋白长度在228~1 706个氨基酸之间，分子质量在26 133.32~192 267.80 u之间，等电点在6.00~9.06之间。二级结构预测分析结果显示，猪DNMT蛋白主要由无规则卷曲组成。亚细胞定位分析发现，5个猪DNMT蛋白定位于细胞核。母猪性腺轴的转录组数据分析发现，PigDNMT1在下丘脑、垂体和卵巢组织中随着初情启动过程而展现出不同的表达模式。【结论】 本研究在猪基因组上共鉴定出5个DNMT基因，并发现性腺轴组织中的PigDNMT1在初情启动过程中呈现出不同的表达模式，为解析猪DNMT基因家族功能提供一些参考。     

牦牛酪蛋白基因家族的克隆及组织表达分析

本研究旨在克隆牦牛酪蛋白基因家族(CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3)的CDS区序列,鉴定其在牦牛不同组织中的表达水平。选取4岁龄左右处于泌乳期的健康类乌齐母牦牛3头,屠宰后分别采集乳腺、心脏、肝脏、骨骼肌组织,分别提取组织总RNA并反转录为cDNA,设计酪蛋白基因家族特异性引物扩增酪蛋白基因家族序列,进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR法分别检测酪蛋白家族基因mRNA水平。结果显示,克隆得到CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3基因cDNA序列分别为919、832、805和715bp,其CDS区全长分别为645、669、690和585bp,分别编码214、222、259和194个氨基酸残基。类乌齐牦牛酪蛋白基因家族与黄牛亲缘关系最近,其次是印度水牛,而与单胃动物猪的亲缘关系最远。组织表达结果显示,酪蛋白基因家族在组织中广泛表达,其中在乳腺组织中的表达量最高,其次是骨骼肌组织。在乳腺组织中CSN1S1、CSN1S2、CSN2基因之间表达量差异不显著(P>0.05),但CSN2基因表达量显著高于CSN3基因(P<0.05)。以上结果为酪蛋白基因家族在牦牛乳腺蛋白质代谢调控机制的研究提供了参考依据。     

干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞乳脂和酪蛋白的影响

通过将小干扰-17β-羟基固醇脱氢酶Ⅳ（si-HSD17B4）基因转染水牛乳腺上皮细胞,检测酪蛋白、甘油三酯含量及脂肪酸相关基因的表达变化,从而揭示干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中乳脂和酪蛋白的影响。采用实时荧光定量PCR检测HSD17B4 mRNA在水牛各个组织中的相对表达量。合成3条水牛HSD17B4小干扰RNA （siRNA）和1条对照si-HSD17B4-nc （si-nc）,并筛选干扰效果最佳的片段和时间。si-HSD17B4转染水牛乳腺上皮细胞后,通过酪蛋白试剂盒检测酪蛋白的表达情况,通过甘油三酯测定和油红O染色检测甘油三酯含量,通过实时荧光定量PCR检测干扰HSD17B4基因对甘油三酯、脂肪酸合成以及氧化相关基因表达的影响。结果表明,HSD17B4基因在水牛心脏和卵巢中相对高表达,且显著高于其他组织（P<0.05）。3条HSD17B4 siRNA片段均能有效地抑制HSD17B4基因的表达,其中si-HSD17B4-1干扰效果最佳,HSD17B4 mRNA表达量极显著低于对照组（P<0.01）;最佳干扰时间为24 h。酪蛋白检测结果显示,干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成无影响。甘油三酯测定结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中甘油三酯含量上升,差异显著（P<0.05）。油红O染色结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中的脂滴明显增多。实时荧光定量PCR检测结果显示,干扰HSD17B4基因会使FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2、PLIN2、BTN1A1基因表达量上调,分别上调9.28（P<0.01）、1.36（P<0.05）、1.17（P<0.05）、1.83（P<0.01）、1.60（P<0.01）和2.17（P<0.01）倍;同时使PPARA、SREBP1C、SCD、ACSS2、ACACA、AGPAT6、LPIN1、XDH、ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因表达量下降,分别下调至50.55%（P>0.05）、61.15%（P<0.01）、84.91%（P<0.01）、89.34%（P<0.01）、21.88%（P<0.01）、86.48%（P<0.01）、25.35%（P<0.01）、27.24%（P<0.01）、41.74%（P<0.01）、22.17%（P<0.01）、62.70%（P<0.01）和70.33%（P<0.01）。结果表明,HSD17B4基因在水牛组织中广泛表达;si-HSD17B4高效抑制HSD17B4基因在水牛乳腺上皮细胞中的表达,未检测到干扰HSD17B4基因对乳腺上皮细胞酪蛋白的影响,干扰HSD17B4基因上调了FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2基因的表达,从而促进甘油三酯的合成,同时降低ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因的表达,减少脂肪酸β-氧化。     

大白猪ZnT基因家族生物信息学分析及组织表达研究

【目的】 分析大白猪溶质载体30A （ZnT）基因家族成员的生物学特性,并检测其在猪不同组织中的表达水平,为研究ZnT基因家族调控锌的代谢提供科学依据。【方法】 使用多种生物信息学软件对猪ZnT基因家族10个成员（ZnT1~ZnT10）进行序列分析,包括基序、保守结构域、跨膜结构域、进化树、蛋白相互作用分析;使用实时荧光定量PCR方法检测ZnT基因家族在6月龄大白猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、乳腺中的表达差异。【结果】 ZnT1~ZnT10基因定位到猪的8条染色体上,分子质量在41.61~85.30 ku之间;等电点介于6.27~9.30之间,其中ZnT6等电点最高为9.30,ZnT1等电点最低为6.27。ZnT基因家族中,除ZnT3外都属于稳定蛋白,除ZnT5、ZnT9外都含有6层跨膜结构域,除ZnT6、ZnT9外所含基序顺序均一致,Cation-efflux是ZnT基因家族共有的保守结构域。ZnT6与ZnT2、ZnT3、ZnT7、ZnT9蛋白关联程度最高,ZnT1与ZnT3蛋白关联程度最高,ZnT8与其他家族成员间关系较远。ZnT基因家族序列在哺乳动物进化过程中相对保守。ZnT基因家族的10个基因在大白猪肺脏中相对表达量较高,在心脏中相对表达量较低,除ZnT5、ZnT7、ZnT9外的ZnT基因家族的其他成员在肌肉中几乎不表达。【结论】 ZnT家族属于跨膜结构蛋白,所含基序顺序基本一致,Cation-efflux是ZnT基因家族共有的保守结构域。ZnT基因家族多数成员在大白猪肺脏中表达量最高,在心脏和肌肉中相对表达量较低。     

水牛GABA A型受体π亚基基因的克隆及其在乳腺组织中的表达

γ-氨基丁酸(GABA)是大脑中一种重要的抑制性递质,除与兴奋的传递有关外,还在内分泌组织中发挥着重要的作用。本研究对水牛GABA A型受体的π亚基基因(GABRP)CDS序列进行了克隆,并对其进行了生物信息学分析,同时应用实时荧光定量PCR和免疫组化技术分析了GABRP基因在水牛乳腺组织中的表达情况。结果表明,应用RT-PCR技术成功获得了广西本地水牛GABRP基因序列,长为1 401bp;BLAST比对结果显示,广西本地水牛的GABRP核苷酸序列与和河流型水牛的同源性为99%,GABRP在不同物种中具有较高的保守性;GABRP蛋白主要在水牛乳腺组织的腺泡上皮细胞中表达,GABRP基因在泌乳期及非泌乳期水牛乳腺组织中都有表达,且非泌乳期GABRP基因的表达显著高于泌乳期(P0.05)。试验结果为进一步研究GABRP基因在水牛乳腺发育过程中的功能奠定了基础。     

奶牛SP1基因结构及对乳脂合成功能的初步分析

旨在探讨中国荷斯坦奶牛的特异性蛋白1（specificity protein，SP1）基因结构特征及其对奶牛乳脂合成的影响。根据NCBI已经公布的奶牛SP1基因序列（NM_001078027.1），利用生物信息学分析其序列保守性、理化性质、蛋白亲水性、蛋白质结构及互作蛋白；采用PCR技术扩增并克隆SP1基因CDS序列。然后，选取6头健康的中国荷斯坦奶牛，分别取泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织，运用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测SP1基因在不同时期奶牛乳腺组织中的表达情况。分离并纯化泌乳期奶牛乳腺上皮细胞，通过SP1过表达及干扰检测其对乳脂合成的影响，分别进行3次独立试验。结果显示，SP1基因序列在不同物种间高度保守，与山羊相似度最高（98.94%）。奶牛SP1基因CDS区序列长2 361 bp，编码786个氨基酸，蛋白分子质量为80 902.17 u，理论等电点为6.94。平均疏水指数为-0.438，为不稳定的亲水性蛋白。SP1序列包含3个锌指结构，SP1蛋白二级结构以无规则卷曲（52.29%）为主。STRING蛋白互作分析结果显示，SP1与转录因子AP-1（JUN）、雌激素受体α（ERα）、MYC原癌基因蛋白（MYC）、TATA盒结合蛋白（TBP）等蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR和Western blot结果显示，SP1的mRNA和蛋白在泌乳期的表达量显著高于干奶期（P<0.01）。在奶牛乳腺上皮细胞中过表达SP1显著增加细胞甘油三酯的合成（P<0.01），而干扰SP1的表达，甘油三酯合成显著降低（P<0.01）。以上结果提示，SP1正向调控乳脂合成，分析SP1基因结构和功能为深入研究SP1对泌乳奶牛乳脂合成调控机制提供理论依据。     

奶水牛乳腺组织学研究报告

[目的]探究水牛泌乳性与乳腺组织的关系。[方法]采用组织切片及显微照相研究摩拉水牛和摩×尼×本三元杂水牛泌乳期的乳腺组织。[结果]泌乳期水牛乳腺结缔组织和脂肪组织较少,腺泡较多。泌乳水牛乳腺组织占62.8%,结缔组织占7.6%,脂肪组织占19.6%。摩拉水牛乳腺小叶区域的乳腺泡数量范围为80～150个/mm2,直径范围为50～100μm。摩×尼×本三元杂水牛泌乳后期乳腺小叶区域的腺泡数量范围为50～100个/mm2,直径范围为50～150μm。[结论]乳腺腺泡数及大小是影响水牛泌乳量的重要内在因素。     

Cloning,Expression Analysis and Regulation of PNPLA8 Gene by Prolactin in Buffalo

In order to investigate the role of patatin-like phospholipase domain-containing 8(PNPLA8) in lipid metabolism of mammary gland in buffalo,the coding region (CDS) was amplified and cloned by PCR based on the sequence of Bos taurus PNPLA8 gene in GenBank (accession No.:XM_005205444.4) were analyzed using bioinformatics software.Total RNA was extracted from different tissues of buffalo and mammary glands,which were harvested from different lactating buffaloes.The expression of PNPLA8 gene mRNA in different tissues and different lactation period was detected by Real-time quantitative PCR.For buffalo mammary epithelial cell treatment,different concentrations of prolactin were used and the effect of prolactin on the expression of PNPLA8 gene was detected by Real-time quantitative PCR.The results showed that the length of the PNPLA8 gene CDS was 2 355 bp,encoding 784 amino acids.The sequence showed high homology with Bos mutes and Capra hircus.PNPLA8 gene was expressed at different levels in 11 tissues examined,with a relatively high level in the lung and mammary tissues while the low level in the fat and muscle tissues.The expression abundance of the PNPLA8 gene was variable during lactation and showed a trend of "low-high-low".Prolactin treatment showed that the expression of PNPLA8 gene decreased with the increase of prolactin concentration.In this study,PNPLA8 gene of buffalo was successfully cloned,and the expression of PNPLA8 gene in different tissues and the lactation period was analyzed.Herein,the effect of prolactin on the expression of PNPLA8 gene was studied that laid a foundation for further research on PNPLA8 gene of mammary gland in buffalo.     

DDR1基因过表达对水牛乳腺上皮细胞的影响

为揭示盘状结构域受体1（discoidin domain receptor1,DDR1）基因对水牛泌乳性能的影响,本研究构建了水牛DDR1基因真核表达载体,并对其最佳转染时间进行摸索,同时分析DDR1基因过表达对水牛乳腺上皮细胞的影响。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,载体片段大小与目标载体片段大小一致,均为8.8 kb,测序结果显示其与目的片段序列匹配率为100%。细胞转染试验结果显示,DDR1基因过表达最佳转染时间为48 h。细胞增殖检测结果显示,DDR1基因过表达组与对照组细胞相对荧光值差异不显著（P>0.05）。细胞凋亡检测结果显示,DDR1基因过表达对水牛乳腺上皮细胞的晚期凋亡率（19.87% VS 17.49%）无影响（P>0.05）,但极显著增加了水牛乳腺上皮细胞早期凋亡率（6.48% VS 1.35%,P<0.01）。同时,DDR1基因过表达上调了水牛乳腺上皮细胞中抑凋亡基因BCL-2和XIAP的表达,而下调了促凋亡基因P53的表达。此外,DDR1基因过表达显著提高了水牛乳腺上皮细胞的迁移率（66.26% VS 58.76%,P<0.05）。综上,试验成功构建了水牛DDR1基因真核表达载体并证明了DDR1基因过表达促进了水牛乳腺上皮细胞的早期凋亡和迁移,为今后进一步研究水牛乳腺发育和泌乳性能提供了一定理论依据。     

水牛黑色素皮质素1受体基因克隆、生物信息学分析及表达模式研究

本试验旨在对水牛黑色素皮质素1受体(MC1R)基因进行克隆、生物信息学分析及表达模式研究。参考牛MC1R基因(GenBank登录号:JN123363.1)序列设计引物,以本地沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增克隆MC1R基因片段并进行测序分析。运用QRT-PCR方法检测摩拉水牛、沼泽水牛、白沼泽水牛和黄牛皮肤组织中MC1R基因的表达模式,并通过Western blotting方法检测沼泽水牛和白沼泽水牛MC1R基因的蛋白表达差异。结果表明,应用PCR方法成功克隆了水牛MC1R基因,其编码区全长954 bp,共编码317个氨基酸。测序分析后发现沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛MC1R基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似性很高。沼泽水牛与白沼泽水牛在476、618、881、930和931 bp位点上分别发生T→C、G→C、G→A、G→A和A→G突变,导致了沼泽水牛和白沼泽水牛第159位氨基酸由丝氨酸变成苯丙氨酸,第310位氨基酸由谷氨酸变成丙氨酸,第294位氨基酸由天冬氨酸变成丙氨酸,发生了非同义突变。QRT-PCR结果发现,MC1R基因在摩拉水牛、沼泽水牛和黄牛皮肤组织中的相对表达量均显著高于白沼泽水牛(P<0.05);Western blotting分析结果显示,沼泽水牛皮肤组织中MC1R蛋白的表达量高于白沼泽水牛。综上所述,白沼泽水牛MC1R基因的编码区发生氨基酸位点突变,且相对表达量和蛋白表达量均低于沼泽水牛,推测此为白沼泽水牛体内合成的黑色素缺失而导致毛色白化的主因。     

Cloning,Bioinformatics and Expression Pattern Analysis of Buffalo MC1R Gene

The aim of this study was to clone and analyze the expression pattern of buffalo MC1R gene.A pair of specific primers was designed according bovine MC1R sequence (GenBank accession No.:JN123363.1),with genome DNA of swamp buffalo,White swamp buffalo,Murrah buffalo and Yellow cattle as template,MC1R was amplified by PCR.Then relative expression level of MC1R gene of swamp buffalo,White swamp buffalo,Murrah buffalo and Yellow cattle was analyzed using QRT-PCR,and protein expression was detected by Western blotting method.The results showed that the 954 bp coding region of buffalo MC1R gene was successfully cloned and sequenced,which code for 317 amino acids.The MC1R gene nucleotide sequences and amino acid sequences of swamp buffalo,White swamp buffalo,Murrah buffalo and Yellow cattle were highly conserved.Five polymorphic sites were found between White swamp buffalo and swamp buffalo of MC1R gene,including 476 T→C,618 G→C,881 G→A,930 G→A and 931 A→G,which caused three nonsynonymous mutation sites of Phe159Ser,Glu310Ala and Asp294Ala.The QRT-PCR result showed that relative expressions of MC1R gene of Murrah buffalo,swamp buffalo and Yellow cattle were significant higher than that of White swamp buffalo (P<0.05).The Western blotting results revealed that MC1R protein expression level in swamp buffalo was higher than that of White swamp buffalo.In conclusion,there were amino acids mutation in White swamp buffalo MC1R gene,and MC1R gene relative expression of White swamp buffalo was lower than that of other buffalo,which was the main reason of lacking of melanin production in White swamp buffalo.