鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离及其N基因序列分析

通过病毒形态观察、血凝特性试验、病毒干扰实验、动物回归实验等分离鉴定了1株鸡肾型传染性支气管炎病毒,命名为LY07.利用RT-PCR技术对分离毒株的N基因进行了扩增,经克隆、序列测定和分析比较,结果表明,N基因全长为1230 bp,编码1条409个氨基酸组成的多肽;其核苷酸与H52、M41和BJ等毒株的同源性为84.4 %～89.7 %,氨基酸同源性为86.1 %～91.0 %;LY07株与LX4、BJ和GDS14株关系较近,与其余鸡传染性支气管炎病毒株的亲缘关系均较远,是1株新的肾型IBV毒株.     

30株鸡传染性支气管炎病毒标准株与分离株SJ基因的克隆及序列分析

利用IBV S1基因特异性引物对30株IBV毒株进行RT-PCR扩增,产物经纯化后进行测序,并利用ONAstar MegAlign软件分析S1基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列。结果表明,广西分离株GXIB／02与Mass41、Conn、Ark、PA、Del、JMK、H52参考株的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性均较低,与美国80年代分离的毒株MW34、hotle、call5、AustT株的序列同源性也很低。这一结果与血清学试验结果相吻合,说明广西分离株GXIB／02与当今流行的标准株以及过去流行的毒株都不相同,是一个新的变异株,由此推断广西已有不同血清型IBV毒株存在,可能导致新的变异株流行。     

IBV陕西分离株M基因的克隆与遗传变异分析

为了研究IBV陕西分离株M基因的遗传变异情况及分子特征,参照NCBI所登录的IBVM基因序列设计了1对引物,应用RT-PCR方法对陕西8株IBV分离株的M基因进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行核苷酸序列及氨基酸序列同源性和进化发生关系分析,并对M蛋白的二级结构和跨膜区进行预测。结果表明,8个IBV分离株间的M基因核苷酸和M蛋白氨基酸同源性分别为92.3%~99.8%和95.4%~100%,分离毒株与参考毒株的M基因核苷酸和M蛋白氨基酸序列同源性分别为87.4%~99.5%和89.4%~99.5%;分离毒株与参考毒株M蛋白的α-螺旋结构主要分布在N端前100氨基酸肽段区,其他的部分主要是β-折叠和无规则卷曲结构;分离毒株的M蛋白均包含有3个跨膜区。表明IBV分离株M蛋白在基因序列和二级结构上相对保守。     

安徽IBV地方株AH1-99株S1基因克隆及序列分析

用RT-PCR技术扩增出IBV AH1-99的S1基因cDNA,将其克隆到pMD18-T载体中进行序列测定和分析.结果表明,该分离株S1基因全长共1 611个核苷酸,编码537个氨基酸;与GenBank中登陆的IBV S1基因核苷酸的同源性为76.5%～92.2%,氨基酸同源性为69.3%～89.8%;在IBV S1基因核苷酸进化关系树中,该分离株同H52、M41和Beaudette等亲缘关系较近,在151位有一个EcoR I 酶切位点,有16个潜在的糖基化位点,前18个氨基酸残基为S蛋白的信号肽.     

陕西省猪瘟病毒流行毒株E2基因变异分析初报

根据GenBank公布的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)Shimen株全基因序列,设计并合成2对引物,用RT-PCR方法对采自陕西省部分地区的30份CSF病料中,CSFV流行毒株的E2基因进行了扩增,并将其克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌DH5α。提取pMD-18T-E2重组质粒,进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定,并对阳性质粒进行测序,将测序结果与HCLV疫苗株和shimen株E2基因及E2蛋白进行序列分析。结果表明,从30份病料中共扩增到10株CSFV流行毒株的E2基因;扩增的10株陕西CSFV流行毒株E2基因同源性为92.3%~99.6%,与Shimen株及HCLV疫苗株的同源性为75.0%~79.4%;10株CSFV流行株E2蛋白的同源性为90.0%~100%,与Shimen株和HCLV疫苗株E2蛋白的同源性分别为78.9%~84.4%和77.8%~83.3%。说明所扩增的10株陕西CSFV流行毒株的E2基因发生了较大变异。     

山羊痘病毒TK基因的克隆与序列分析

设计特异性引物并应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B株TK基因序列片段,将其克隆至pMD 18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-TK.再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定.TK基因核苷酸和氨基酸同源性分析表明,4株测序毒株TK基因与参考毒株的同源性均为96.6%～100%,说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性.     

30株鸡传染性支气管炎病毒标准株与分离株S1基因的克隆及序列分析

利用IBVS1基因特异性引物对30株IBV毒株进行RT-PCR扩增,产物经纯化后进行测序,并利用DNAstar MegAlign软件分析S1基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列。结果表明,广西分离株GXIB/02与Mass41、Conn、Ark、PA、Del、JMK、H52参考株的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性均较低,与美国80年代分离的毒株MW34、hotle、cal15、AustT株的序列同源性也很低。这一结果与血清学试验结果相吻合,说明广西分离株GXIB/02与当今流行的标准株以及过去流行的毒株都不相同,是一个新的变异株,由此推断广西已有不同血清型IBV毒株存在,可能导致新的变异株流行。     

鸡肾型IBV地方分离株N基因的克隆及分子遗传变异分析

用RT-PCR方法对分离于陕西省不同地区的8个鸡肾型IBV毒株的Ⅳ基因分别进行了扩增,将各扩增产物与T载体连接后,转化感受态细胞筛选阳性克隆质粒并进行基因测序,用DNAstar软件将这8个毒株与GenBank收录的7个IBV代表毒株的Ⅳ基因进行了比较分析,研究了其变异情况。结果表明,B01,YL,WH和 YX株与7株代表毒株的同源性较高,而G,BJ,WG,FF株与7个代表毒株的同源性相对较低。氨基酸推导序列比对结果表明,N蛋白突变以散在的点突变形式为主,其中46,48,50,75,78,189,232,236,237,299,301,350,366等位点容易发生突变,突变位点无明显规律性。     

鸡传染性支气管炎病毒河南分离株S1基因克隆及遗传变异分析

根据GenBank中已发表的传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因,设计并合成了1对引物,采用RT-PCR技术扩增鸡传染性支气管炎病毒河南分离株(HN0501)S1基因,并进行克隆和测序.结果表明,所克隆的片段大小为1739 bp,包含S1基因和部分S2基因,S蛋白切割识别位点序列为RRSRR.序列比较分析发现,IBV HN0501株S1基因与澳大利亚N1株、吉林JAAS株S1基因核苷酸同源性分别为99.6%,99.8%,氨基酸同源性均为99.3%,而与其它支气管炎病毒株核苷酸同源性为66.4%~85.2%.通过IBV S1基因系统进化分析,结果发现HN0501株与N1株、JAAS株的亲缘关系近,而与其它支气管炎病毒株的亲缘关系均较远.进一步证实IBVHN0501株为IBV肾型株.     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆及序列分析

应用RT-PCR方法,以1株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,扩增了NA全基因cDNA。将NA cDNA克隆于pMD18-T栽体,并对其进行了测序。测序结果表明：所克隆的NA基因全长为1416bp,编码区为1410个核苷酸,编码469个氨基酸。将其序列与5株H5N1亚型禽流感病毒NA基因序列进行比较,其核苷酸和氨基酸同源性均为96.6％～99．1％。NA的克隆和分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系。     

传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白基因变异及在大场杆菌中的表达

核衣壳蛋白(N)是传染性支气管炎病毒的主要结构蛋白之一. 以前的研究结果显示IBV-ZJ971毒株以引起腺胃肿大为特征,IBV-X和N毒株以引起肾炎为特征.为了探讨不同组织嗜性传染性支气管炎病毒N基因的变异,我们依据已发表的IBV- Beaudette 毒株N基因的序列设计和合成引物,RT-PCR扩增IBV-ZJ971、N、X和H52的核衣壳蛋白基因,并测序、分析和在E.coli中进行表达.结果显示:IBV-ZJ971、N、X和H52毒株的N基因的ORF由1230 bp组成,编码409个氨基酸.与来源于GenBank中的IBV毒株比较,IBV-ZJ971、N、X和H52与其它IBV毒株的核苷酸同源性分别是87.0-98.6%、86.6-99.7%、86.3-99.7%、87.2%-98.5%,氨基酸的同源性分别是90.0-97.8%、 90.5-98.8%、 90.0-98.8%、 91-98%.IBV-ZJ971毒株的N蛋白不同于其他IBV的独特变异是111,117, 142, 171 和 401位点上的氨基酸改变,IBV-N和X毒株的N蛋白不同与其它IBV的独特变异是46, 48, 189,190, 220, 223, 236, 237, 240, 286, 299, 301 334, 335, 336 and 351位点上的氨基酸改变.说明IBV嗜腺胃毒株(ZJ971)和嗜肾毒株(N和X)的N基因以散在的点突变为特征.将IBV-ZJ971毒株的N基因在E.coli中表达,并用western-blotting检测,发现IBV-ZJ971的N蛋白是一分子量约为45 kD的蛋白.     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株膜蛋白基因的分子特征分析

根据GenBank中已经公布的鸡传染性支气管炎病毒株M基因序列,设计并合成1对特异引物,利用RT-PCR方法扩增出IBV河南分离株HN99株M基因的全长片段,然后进行克隆、测序,获得了长度为669 bp的HN99株M基因全序列,编码M蛋白222个氨基酸残基,其N端的前60 nt为前导序列,近N端含有1个潜在的N-糖基化位点,M基因编码的膜蛋白中含有9个高度保守的半胱氨酸;HN99株M蛋白点突变较多,且突变位点呈散在分布遍及整个ORF,主要表现为碱基的插入和缺失,在Glu 21～Leu 37,Set 45～Ile 68,Pro 74～Phe 94位氨基酸的区域内形成3个跨膜区域,在39 Try～43 Thr,171 Ile～176 Pro,183 Arg～193 Ser住氨基酸处含有3个潜在的抗原位点;与GenBank中的11个国内外参考毒株相比,IBV-HN99株M基因核苷酸同源性为87.0%～90.3%,推导的氨基酸同源性为89.7%～94.2%;在系统发生进化树中,HN99株M基因与其他参考毒株属于不同的分支,亲缘关系均较远.     

H5N1禽流感病毒HA基因的重组腺病毒表达载体的构建

采用PCR方法扩增出禽流感病毒HA基因,将其定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中构建pAdtrack-H5,之后将pAdtrack-H5与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-H5,将pAdeasyd-H5经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞株,包装出含有HA基因的腺病毒pAd-H5。结果表明:含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-H5和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-H5经PCR、双酶切及核苷酸测序鉴定无误。包装成功的腺病毒pAd-H5经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。     

PRRSV河南株ORF7基因的克隆表达及条件优化

从猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)河南分离株(HN07-1、HN07-2)的细胞培养物中提取RNA,根据参考株IAF-exp91 N蛋白基因序列设计出2对引物,成功克隆出ORF7全长基因,并连接至pMD-19T栽体.基因测序结果表明,2株PRRSV河南分离株ORF7基因序列完全相同;该序列与HB-4(hs)同源性为...     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株N基因在大肠杆菌中的表达及产物免疫活性检测

鸡传染性支气管炎病毒HN99株核蛋白(N)基因PCR产物经BamHⅠ、HindⅢ双酶切,克隆入大肠杆菌原核表达载体pMAL-p2X,构建重组表达质粒pMAL-p2X-N,转化大肠杆菌TB1并进行诱导表达。通过pMALTM融合蛋白纯化系统对表达产物进行非变性纯化,将纯化的N蛋白按常规方法免疫新西兰大白兔,制备兔抗鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的多克隆抗体,并用ELISA法检测其生物活性。结果表明,表达的重组核蛋门纯化后出现2条带,相对分子质量分别约为92和82 ku,与Western blot出现的2条蛋白带一致;纯化的重组蛋白经裂解因子作用后,出现2条蛋白带,相对分子质量分别为45和35 ku,与预期结果相符合;制备的多克隆抗体可与不同鸡传染性支气管炎病毒株发生反应,与亲本毒株的反应性略高于与其他毒株的反应性。以上结果表明,原核表达的可溶性N蛋白具有高度的生物活性,有望作为新的基因工程抗原用于鸡传染性支气管炎病毒的群特异性诊断。     

鸡传染性支气管炎病毒H52毒株S基因的克隆及序列分析

将含有鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52毒株的尿囊液浓缩,用TRIzol 试剂抽提病毒RNA作为反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的模板,参照已发表的IBV-Beaudette 株S基因序列,设计并合成一对特异性引物,扩增得到长度约3.6 kb 的S基因片段,利用引物设计中EcoR I和BamH I 酶切位点插入到克隆载体pBlueScript SK 的多克隆位点中,转化感受态E.coli DH5α.经酶切分析和PCR等方法鉴定,筛选出阳性克隆,进行核苷酸序列测定,证实获得了S 基因的全长序列.利用DNAstar等分析软件与GenBank中其它IBV毒株的核苷酸及其推导的氨基酸进行序列同源性比较分析,结果表明,H52毒株与已报道的核苷酸的同源性在83.45%～99.71%之间,氨基酸的同源性在82.10%～99.26%之间.     

RT- PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立

根据Genbank中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(NP)基因序列,设计了1对引物,通过鸡胚繁殖IBV,纯化鸡胚尿囊液中的IBV,提取病毒RNA,建立了检测传染性支气管炎病毒的RT-PCR方法。对IBV各毒株(M41,H52,H120,Aust-T以及野毒株等)检测,结果均为阳性,而对鸡的其他病毒性疾病病毒(IBDV,AIV,NDV)进行检测,结果均为阴性。初步结果表明所建立的RT-PCR技术可用于鸡传染性支气管炎病毒各血清型毒株的检测。