吉林省猪圆环病毒3型的分子流行病学调查及遗传演化分析

为了解猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)在吉林省的流行情况和分子生物学特性,本研究通过PCR方法对吉林省2015-2017年的484份血清样品进行PCV3检测,将PCV3检测阳性的样品进行ORF2基因扩增和测序,并利用生物信息学软件DNAStar和Mega 6.06对ORF2基因的分子生物学特性进行分析。结果显示,吉林省2015-2017年PCV3样品总感染率和猪场感染率分别为28.1%(136/484)和65.8%(25/38),且呈逐年上升趋势。同源性分析结果表明,本研究获得的4株PCV3 ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.3%～98.9%和97.7%～99.5%,4株PCV3 ORF2基因与国内外参考毒株ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.7%～99.7%和96.7%～100%。遗传进化分析表明,PCV3存在2个亚群:PCV3a和PCV3b。本试验分离的PCV3毒株分别位于2个亚群上,1株属于PCV3a亚群,3株属于PCV3b亚群。PCV3毒株Cap蛋白第24(A、V)和27位(R、K)氨基酸的不同可能与PCV3毒株的进化相关。本试验结果表明,PCV3在吉林省猪群和猪场中存在很高的感染率,PCV3毒株之间高度保守,本研究结果为PCV3的分子特性研究提供了参考依据。     

北京市猪场猪圆环病毒3型感染状况调查及其ORF2基因遗传进化分析

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在北京市不同区县猪场中的流行情况,研究建立PCR检测方法,对来自北京市8个区县56个养殖场的1177份临床样品进行检测,并对获得的部分ORF2全基因序列进行遗传进化分析。结果显示,PCV3总体阳性率为1.0%(12/1177),猪场阳性率为8.9%(5/56)。对PCV3阳性样本进行ORF2基因测序及同源性比对,共测得12株PCV3 ORF2全长基因序列,其中包括6株不同的ORF2全长基因序列。结果显示,该6株序列之间的核苷酸相似性为97.7%～99.5%,推导氨基酸序列的相似性为97.2%～100%;与参考毒株之间的核苷酸同源性为96.0%～99.5%,推导氨基酸同源性为92.1%～100.0%;进化树显示北京毒株属于PCV3b基因型。试验表明,PCV3在北京多个猪场呈现一定的流行趋势,流行毒株以PCV3b基因型为主。     

4株猪圆环病毒2型凉山州分离株全基因组进化分析

为了解猪圆环病毒2型(PCV2)凉山州分离株的基因型,本研究采用PCR方法对采自凉山州3个发病猪场的4个PCV2阳性样品进行全基因组序列的扩增、克隆、测序分析,并绘制遗传进化树。结果显示:4个PCV2凉山州分离株全基因组序列长度均为1767 bp,核苷酸同源性为99.4%~99.8%,与国内外101株PCV2参考毒株核苷酸同源性为93.8%~99.9%,与4个PCV2国产疫苗株核苷酸同源性为95.1%~96.0%;4个分离株ORF1和ORF2基因核苷酸同源性分别为99.3%~99.8%和99.6%~100%;构建的系统进化树显示,4个分离株均为PCV2d亚型,与YA1株(四川雅安,MH094769)的亲缘关系最近。本研究为凉山州PCV2疫苗毒株的选择提供了科学依据。     

福建省新发猪圆环病毒3型流行病学调查及遗传变异分析

猪圆环病毒3型(PCV3)是新发现的一种猪圆环病毒,该病毒可以引起猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、母猪繁殖障碍和全身多器官的炎症反应。为了解福建省PCV3流行株的现状、分子生物学特征和遗传演化规律,本研究采集福建地区规模化猪场120份临床表现繁殖障碍和呼吸道疾病的组织样品,采用PCR方法对其进行PCV3检测。结果显示福建省猪场PCV3的感染率为12.5%。对福建省5株PCV3全基因组进行序列分析,结果显示,5株PCV3间核苷酸同源性为98.2%~99.6%,与国内PCV3分离株的核苷酸同源性为97.6%~100%,与美国分离株(PCV3-US/MO2015、PCV3-US/MN2016、PCV3-US/SD2016、PCV3 2164和PCV3 29160)的核苷酸同源性为97.8%~99.3%,而与PCV2的核苷酸同源性为43.8%~44.1%,与我国蝙蝠圆环病毒的核苷酸同源性为49.2%~51.1%。PCV3系统进化树结果显示,福建省5株PCV3处于3大亚群,1株属于3a亚群,1株属于3b亚群,3株属于3c亚群。其氨基酸序列分析显示PCV3 Cap蛋白比较保守,仅存在个别位点的氨基酸突变。本研究为福建省PCV3的分子流行病学、疫苗研究和有效防控提供实验依据。     

1株犬源PCV3的全基因克隆与序列分析

根据GenBank上已发表的PCV3毒株序列设计1对检测引物和2对扩增全长引物。应用检测引物对广西地区的犬血清样品进行PCR检测,应用扩增全长引物对检测阳性样品进行PCR扩增、克隆和测序,并对其全基因序列进行分析,绘制遗传进化树。结果显示,广西地区147份犬血清样品中,阳性样品为36份,感染率为24.3%。本试验成功扩增1株2 000 bp的PCV3毒株的全基因核苷酸序列,并命名为PCV3/Guangxi-5。将PCV3/Guangxi-5序列与NCBI公布的PCV3的参考序列进行同源性比对,结果显示PCV3/Guangxi-5与参考序列的全基因序列同源性为98.9%～100.0%,其中与DE27.16同源性最低,与PCV3/CN/Chongqing-148/2016同源性最高。应用MEGA7.0对PCV3进行ORF2基因的氨基酸序列进行比对发现,第24位至第27位氨基酸存在6种形式,分别为VRRK、ARRR、ARKR、LRRK、VRRR和ARRK。利用MEGA7.0软件中Maximum Likelihood (ML)法p-distance模式构建基于ORF2基因和PCV3全基因的系统发育分析表明,PCV3可分为PCV3a和PCV3b等2种基因型,本试验获得的PCV3/Guangxi-5为PCV3a亚型,其ORF2基因与PCV3/CN/Liaoning-23/2016亲缘关系最近,与NWHEB21、毒株亲缘关系相距最远;其全基因组与CN/Jiangxi-62/2016毒株亲缘关系最近,与CNFJ-1毒株亲缘性最远。结果表明,广西地区犬群普遍存在感染PCV3的情况,理论上丰富了广西地区PCV3的流行病学资料,为PCV3的防治措施的制定和流行病学研究提供一定的参考依据。     

猪圆环病毒2型吉林分离株的全基因组序列分析

采用PCR扩增1株吉林新分离的PCV2-2017全基因组序列,经过测序拼接后进行了序列分析。毒株PCV2-2017基因全长1 767 bp,在GenBank上进行同源性比对,同源性在96%～99%之间;与法国株AF055394同源性可达99%,与美国株AF055391、四川株HM102350同源性最低,为96%。PCV2中ORF1编码Rep蛋白,核苷酸和氨基酸同源性达到99%,ORF1突变很小,相对保守;ORF2基因全长为702 bp,编码Cap蛋白,氨基酸同源性达94%～99%,核苷酸同源性与美国株比对,可达96%,与法国株和国内部分毒株同源性达99%,是变异主要发生部位,共有12处点突变;ORF3编码蛋白,核苷酸同源性高达100%,说明变异不大。基因的遗传进化分析表明,PCV2-2017吉林新分离株全基因组与法国株AF055394亲缘关系最近,同属于PCV-2b亚型;与AY322001、AB426905和国内GU370064、AY691169、AY969004、DQ180393毒株亲缘关系较远。     

广西地区猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型基因型监测及遗传进化分析

为了明确猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)和猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV-3)在广西地区的分子流行病学情况,试验通过PCR方法对2017年来自广西不同地区的80份猪肺脏样品进行PCV-2和PCV-3核酸检测,并对PCV-2和PCV-3的阳性样品进行ORF2基因的扩增和测序,同时利用生物信息学软件DNAStar和MEGA 6.06对PCV-2和PCV-3的ORF2基因进行同源性分析和构建遗传进化树。结果表明:2017年广西地区PCV-2和PCV-3的总感染率分别为43.8%(35/80)和33.8%(27/80),PCV-2和PCV-3的共感染率为16.3%(13/80)。试验获得的19个PCV-2 ORF2基因序列之间的核苷酸同源性为93.6%～99.9%,对应氨基酸同源性为93.1%～100%;19个PCV-2 ORF2基因序列与国内外参考毒株ORF2基因序列的核苷酸同源性为82.8%～99.9%,对应氨基酸同源性为83.3%～99.6%。试验获得的2个PCV-3 ORF2基因序列之间的核苷酸同源性为99.8%,对应氨基酸同源性为100%;2个PCV-3 ORF2基因序列与国内外参考毒株ORF2基因序列的核苷酸同源性为97.7%～99.8%,对应氨基酸同源性为96.2%～100%。获得的19个PCV-2 ORF-2基因序列中,12个为PCV-2b亚型,7个为PCV-2d亚型;获得的2个PCV-3 ORF2基因序列为PCV-3a亚型,与丹麦和中国湖南分离得到的PCV-3亲缘关系较近。说明PCV-2和PCV-3在广西地区猪群中感染率很高,PCV-2感染主要以PCV-2b亚型为主,PCV-3之间高度保守,分布无地域性规律。     

广西北部湾地区猪圆环病毒2型检测及其ORF2遗传变异分析

为了解猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)在广西北部湾地区的流行情况和其ORF2基因的遗传变异规律,本研究采用PCR方法对2016年采自广西北部湾地区规模猪场和农村散养户的306份疑似PCV2感染猪的血液和组织样品进行了PCV2的病原学检测,同时对分离的4株PCV2 ORF2基因进行PCR扩增、克隆和测序,并与Gen Bank中登录的34株国内外PCV2参考株ORF2序列进行比对和遗传进化分析。结果表明:PCV2检测阳性样品为129份,阳性率为42.16%。随机选取的4份阳性病料PCV2 ORF2基因测序结果显示,4个毒株遗传关系上均属于Group 1(PCV2b),其中BBW-1和BBW-2分离株属于1A分支且分别与Fd3株(AY321984)和NL_PMWS_3株(AY484415)同源性较高,BBW-3和BBW-4分离株属于1B分支且BBW-4分离株与Hu Zhou0301株(AY536756)和NL_Control_1株(AY484407)同源性较高,其ORF2基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.9%~99.5%和93.9%~95.4%,说明该地区PCV2的优势基因型是PCV2b。研究结果不仅有利于掌握广西北部湾地区PCV2流行毒株同源性情况,而且将为该地区(porcine circovirus associated disease,PCVAD)的防治和新型疫苗的研制提供依据。     

猪圆环病毒2型湖南株的分离及全基因组序列分析

为了解湖南省猪圆环病毒2型(PCV2)的来源及与其他地区毒株的关系,从湖南省疑患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMW S)猪群中分离PCV2毒株1株(PCVHunan),提取病毒DNA,进行PCR扩增,扩增产物经克隆与酶切鉴定,获得1.7 kb片段的阳性重组质粒,对其进行全基因组测序分析,与Genbank中已知全基因组序列进行同源性比较。结果,该序列与国内外毒株核苷酸同源性为93.0%~97.7%,其中与美国株(AR145609)及澳大利亚株(AY424405)同源性最高,为97.7%。2个主要阅读框(ORF1与ORF2)氨基酸序列与国内外毒株同源性分别为98.4%~99.4%和88.0%~95.7%。     

2010-2013年四川地区猪圆环病毒2型的分子流行病学调查

为了掌握四川地区近年猪圆环病毒(PCV2)的分子流行和分子进化动态规律。将2010-2013年期间采集自四川成都、德阳、雅安、西昌、遂宁、乐山、资阳等11个养猪地区的疑似PCV2病料共324份进行了检测与分析。设计1对检测PCV2的特异性引物,PCR检测病料表明PCV2阳性为229份,PCV2感染率为70.7%。随后对本实验室分离到的11株PCV2分离毒株进行全基因组克隆与序列分析,11株PCV2四川分离株的全基因组序列分析均为PCV2b基因型,各地分离株之间的全基因同源性为95.2%⁹9.7%,与参考毒株之间的全基因同源性分别为94.1%99.7%,与参考毒株之间的全基因同源性分别为94.1%⁹9.7%;与国内外参考毒株相比,ORF1的核苷酸及推导氨基酸的序列的同源性分别为96.7%99.7%;与国内外参考毒株相比,ORF1的核苷酸及推导氨基酸的序列的同源性分别为96.7%¹00%、98.4%100%、98.4%¹00%,ORF2核苷酸及推导氨基酸的序列的同源性88.0%100%,ORF2核苷酸及推导氨基酸的序列的同源性88.0%⁹9.7%、85.4%99.7%、85.4%¹00%,序列分析发现ORF2变异位点较多,而ORF1相对较保守。本研究结果显示:2010-2013年间,四川地区PCV2感染率高,主要分布在乐山、德阳等市,且流行的基因型以PCV2b为主。     

10株广西猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列的遗传变异分析

为了解广西猪群猪圆环病毒3型(PCV3)的遗传变异情况,以PCV3阳性DNA为模板,利用PCR的方法分2段扩增PCV3全基因序列并进行拼接,获得10株PCV3全基因组序列,全长均为2 000 bp。10株广西PCV3全基因组序列之间的核苷酸同源性为98.6%～99.8%。与国内其他毒株的同源性为97.9%～99.8%;与国外其他毒株的同源性为98.8%～99.7%。10株广西PCV3 Cap基因的大小均为645 bp,编码214 aa。PCV3 Cap基因比较保守,10株广西PCV3 Cap基因与参考株相比,仅存在散在的突变位点。基于PCV3全基因和Cap基因构建的遗传进化树显示,两者结果基本相同,10株广西PCV3处于3a和3b两个亚群。本试验表明,广西地区猪群中流行的PCV3至少存在2个亚群,不同亚群PCV3毒株的致病性差异还有待进一步的研究。     

福建地区猪瘟病毒流行株基因分型及E2基因遗传变异分析

为了解福建地区2013—2014年猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的分子生物学特性与变异规律,采集了福建地区多个猪场的40份疑似猪瘟样品,应用RT-PCR技术对E2基因的主要抗原编码区进行扩增及序列分析,其中31份为猪瘟阳性。序列分析结果表明,31株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为78.5%~100.0%和82.2%~100.0%,与国内外分离株的核苷酸同源性为81.1%~98.9%,氨基酸同源性为79.8%~95.6%;遗传进化树分析表明,31株CSFV属于1.1和2.1亚群,其中23株为1.1亚型,8株为2.1b和2.1c亚群,没有发现2.2和2.3亚群毒株。氨基酸序列分析表明,流行株在免疫逃逸相关位点705,713,729和734位氨基酸发生变异,FJ02毒株B细胞表位关键位点771位氨基酸发生变异,表明福建地区CSFV流行毒株呈现遗传变异多样性。     

2013~2017年江西省猪圆环病毒2型分子流行病学调查

为掌握江西地区猪圆环病毒2型（PCV2）的分子流行病学及其遗传变异情况,本研究运用实验室已建立的PCR方法对2013~2017年采集自江西省南昌市、宜春市、新余市、赣州市、吉安市、九江市、上饶市、抚州市、景德镇市、鹰潭市等10个地区的1 082份疑似PCV2感染猪病料组织进行病原学检测,并通过PCR扩增、克隆和基因测序对PCV2的全基因组序列进行分析。研究表明,1 082份病料中有610份为PCV2阳性,总阳性率为56.4%,其中2013~2017年阳性率分别为52.7%、48.8%、58.5%、71.0%和67.4%。共获得89株PCV2全基因组序列,其中有83株为PCV2b基因型,其中53株归类于PCV2b-1C基因亚群,30株归为PCV2b-1A/1B基因亚群;6株为PCV2a型。测序毒株与参考毒株ORF2基因核苷酸、氨基酸序列同源性分别为88.9%~100.0%和86.0%~100.0%;氨基酸序列分析表明,Cap蛋白存在20个氨基酸突变位点。本研究表明,江西地区猪群中PCV2的主导基因型为PCV2b,其中又以PCV2b-1C基因亚群占据主导地位,同时也存在少量PCV2a基因型。     

6株猪圆环病毒2型山东分离株ORF2基因的克隆与序列分析

分别从山东省6个地区的猪圆环病毒2型(PCV2)阳性病料中PCR扩增ORF2基因。以ORF2为靶基因进行6个毒株的分子流行病学分析。序列同源性分析表明,6个毒株之间的核苷酸序列同源性为93.3%～99.7%,氨基酸序列同源性为92.3%～100%;氨基酸序列存在2个高变区,分别位于序列的57～90和190～220位区域,其中57～90区域位于结构蛋白的免疫反应活性区;遗传进化树分析显示,SDI、SD Ⅲ、SD Ⅴ、SD Ⅵ与法国株和中国农大株共同形成一群,可能起源于共同的祖先;SD0282、SD Ⅳ与其他7株PCV2毒株共同形成另一大群,与海南株的亲缘关系最近;结合GenBank报道的山东境内分离的13个毒株的ORF2基因序列进行RFLP分析,可将该省PCV2流行毒株分为CHN-2H型、CHN-2F型、CHN-2I型和二种新的基因型,命名为CHN-2J和CHN-2K型。其中,CH-2H型所占比例最高,为优势基因型,是引起该省规模化猪场暴发PCV2疾病的主要基因型,因此研制防治该省PCV2的疫苗应以此基因型为主。     

福建省新发猪圆环病毒3型分子流行病学调查及其Cap基因分子特征

为了解2015―2017年福建省新发猪圆环病毒3型(PCV3)的流行现状、分子生物学特征和遗传演化规律,收集福建省不同地区186个猪场的267份疑似PCV3感染猪的组织病料进行分子流行病学调查,并对其Cap基因进行了遗传变异分析。结果显示,福建地区PCV3猪场总阳性率为30.11%,疑似样品总阳性率为21.72%,且呈逐年增高的趋势;17株PCV3福建分离株与其他17株国内外参考毒株Cap基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性较高,分别为96.0%～100.0%和96.3%～100.0%,表明这些毒株可能有相同的进化来源;氨基酸多序列比对发现,Cap基因氨基酸序列最有特征性的是第168位(R→K)和173位(L→F)的氨基酸替换,该位点的突变可能是该地区流行的PCV3毒株的一个重要分子特征;同时,抗原性分析发现第173位(L→F)的突变还位于Cap蛋白的抗原表位区内。遗传进化树分析结果表明,17株PCV3福建分离株中有2株属于3a亚型,其余15株属于3b亚型,表明当前福建地区PCV3流行毒株主要为3b亚型。     

云南省部分猪场病料猪圆环病毒3型PCR检测及克隆测序

为了解猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)在云南省的流行及遗传进化情况,2020年10—12月收集云南省部分猪场疑似病料共24份,采用PCR方法进行PCV3病原检测;选取PCV3阳性扩增产物进行克隆测序,并将测序结果与16株国内外参考毒株进行ORF2核苷酸序列同源性分析。结果显示:24份病料样品中检出阳性5份,阳性检出率为20.8%;克隆出的阳性扩增产物(YNJS-2020)ORF2核苷酸序列和国内外参考毒株的同源性较高,为97.4%～98.9%,其中与西班牙毒株MF80572000同源性最高,与安徽14-201611毒株同源性最低。结果表明,云南省存在PCV3流行,且流行毒株与国内外其他毒株遗传关系较近,但也有一定差异。结果提示,云南省应加强对PCV3的监测及其流行的控制,避免PCV3大面积流行。本研究为云南省PCV3基因型分析和疫苗研究提供了一定的数据基础。     

2008～2011年中国部分地区猪圆环病毒2型的分子流行病学调查

为了解2008~2011年中国部分地区猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)分子流行病学变化趋势,本实验室共采集福建省、江西省、广东省、安徽省、浙江省、河南省、河北省、广西壮族自治区、内蒙古自治区、上海市、江苏省和山西省共12个省(市、区)的健康猪群和发病猪群共452份样品,对其进行病原学检测,并通过扩增、克隆和测序共获得31株PCV2 ORF2基因编码序列。结果显示,452份样品中,有354份样品检测为PCV2阳性,感染率高达78.3%。对31株ORF2基因序列的分析和比对结果表明,31株PCV2均为PCV2b基因型,其中有21株归类于PCV1A/1B基因亚群,而10株为PCV1C亚群;对31株PCV2 ORF2编码氨基酸序列比对分析表明PCV2基因亚型具有其特异的氨基酸变异位点,这对于临床上区别PCV2亚型具有一定的指导意义。从基因水平上来说,自2008年以来中国以PCV 1A/1B亚群为主要流行致病株,但值得我们关注的是,PCV 1C亚群毒株从无到有并有逐渐增多的趋势,将来可能在PCV2的流行毒株中占据主要地位。     

猪圆环病毒2型四川分离株ORF2基因的克隆与序列分析

对临床分离毒株PCV-2 sch2010 ORF2基因全序列进行了克隆和序列分析.结果表明,PCV-2sch2010 ORF2全基因共705 bp,编码234个氨基酸,与GenBank发表的21株PCV-2的ORF2参考序列的核苷酸氨基酸序列同源性分别为88.4%～99.7%和87.2%～99.6%;与2株PCV-1 ORF2(GU371908、FJ475129)的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为58.7%～59.5%和62.8%～64.5%;PCV-2 sch2010分离株与PCV-2的欧洲分支群亲缘关系较近.     

PRRSV安徽分离株NSP2和ORF7基因的克隆与序列分析

2008年从安徽两个发病猪场采集疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,在Marc-145细胞上盲传4代～5代,发现明显细胞病变,各分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HS08株和ZJ08株)。用RT-PCR扩增这两个分离毒株的NSP2和ORF7基因,进行克隆和序列分析。结果表明,这两个分离毒株核苷酸同源性高于99.0%;在NSP2基因上,这两个分离毒株均发生30个氨基酸的不连续缺失,它们与CH-1a株之间核苷酸同源性分别为80.7%和80.2%;在ORF7基因上,与2007年国内高致病性猪蓝耳病毒株HuN4核苷酸同源性较高,分别为98.4%和99.5%,且ORF7基因均存在K46→R46,H109→Q109,V117→A117氨基酸突变。这些信息显示这两个安徽分离株属美洲型毒株,具有高致病性特征,与国内高致病性毒株位于同一基因群。     

一株类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒的全基因组序列分析

为监测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的基因变异情况,采用RT-PCR方法对某猪场疑似患有猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的猪组织样品进行鉴定,测序获得全基因,并对该毒株的NSP2基因缺失特征同源性和遗传进化及重组情况进行分析。结果显示:该猪场感染猪体的病原体为PRRSV,该毒株被命名为180404-2fei;180404-2fei毒株的NSP2区存在131(111+1+19)个氨基酸的不连续缺失,与报道的类NADC30毒株缺失特征一致;180404-2fei的NSP2基因与NADC30毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为92.2%和90.1%,180404-2fei毒株的ORF5基因与NADC30的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为93.5%和92.0%;遗传进化和重组分析结果表明,180404-2fei毒株属于NADC30-Like亚群,可能是由NADC30与HP-PRRSV重组而来。本研究通过对一株类NADC30 PRRSV的全基因组序列进行分析,为研究PRRSV的遗传变异和PRRS的防控提供了参考依据。