牛源坏死梭杆菌43K外膜蛋白的黏附特性研究

旨在明确牛源坏死梭杆菌43K OMP的黏附特性。将43K OMP基因克隆连接至pET-32a载体,转化入大肠杆菌BL21 DE3中,通过IPTG诱导进行原核表达,应用黏附试验、天然蛋白竞争试验、抗体抑制试验和蛋白酶水解试验,明确牛源坏死梭杆菌43K OMP的黏附性,同时将纯化的重组蛋白和提取的天然43K OMP与牛子宫内膜细胞和牛乳腺上皮细胞共孵育,观察43K OMP对细胞的黏附作用。结果显示：43K OMP基因克隆到pET-32a载体中,随后在大肠杆菌BL21 DE3以包涵体形式成功表达;携带重组质粒(H2019)的大肠杆菌经IPTG诱导后,与空载体对照相比,与宿主细胞的结合显著增强(P<0.05);天然43K OMP与细胞共孵育后,黏附细胞的细菌数量显著降低(P<0.05);H2019与43K OMP多抗或单抗预孵育后,显著降低黏附宿主细胞的细菌数量(P<0.05);经不同浓度蛋白酶K处理H2019后,黏附细胞的细菌数量显著降低(P<0.05),且与蛋白酶K浓度呈现剂量依赖关系。同时,43K OMP天然蛋白和重组蛋白能黏附于牛子宫内膜细胞和乳腺上皮细胞表面。...     

敲低SQLE基因对奶牛乳腺上皮细胞增殖及凋亡的影响

为了探讨角鲨烯环氧酶（squalene epoxidase,SQLE）基因对体外培养奶牛乳腺细胞凋亡及增殖的影响,本研究用RNAi技术敲低奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因;用实时荧光定量PCR方法检测奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因及凋亡和周期相关基因的表达;用CCK-8法检测其对细胞增殖的影响;用周期和凋亡检测试剂盒筛选细胞,用流式细胞术准确计数处于不同周期的细胞数和凋亡细胞数。结果显示,奶牛乳腺上皮细胞转染siRNA后,SQLE基因相对表达量显著下降（P<0.05）,细胞增殖受到极显著抑制（P<0.01）;G1期细胞数量显著下降（P<0.05）,G2期细胞数量没有显著性改变,S期细胞数量显著上升（P<0.05）;肿瘤坏死因子超家族成员6（又称Fas或CD5）的相对表达量显著上升（P<0.05）,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B（cyclin dependent kinase inhibitor 1B,P27）相对表达量显著上升（P<0.05）,而细胞周期素D1（Cyclin D1）、B淋巴细胞瘤因子2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A,P21）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X,apoptosis regulator,Bax）显著下降（P<0.05）。综上所述,敲低SQLE基因通过调节相关基因的表达抑制乳腺上皮细胞的增殖。     

DDR1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的调控作用

旨在通过干扰或过表达盘状蛋白结构域受体1（DDR1）基因,探讨其对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及周期的影响。本研究将DDR1基因小干扰RNA片段和过表达载体pcDNA3.1-DDR1转染奶牛乳腺上皮细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中DDR1的干扰和过表达效果;利用CCK-8法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡（早凋、晚凋）的变化;利用qRT-PCR检测增殖与凋亡相关基因的表达情况。结果,在奶牛乳腺上皮细胞中干扰DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别下调94%和30%,而过表达DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别上调68.24和1.38倍;干扰DDR1极显著抑制细胞的增殖（P<0.01）,细胞早凋与晚凋比例极显著上升（P<0.01）;干扰组G1期细胞比例极显著上升（P<0.01）,S期细胞比例极显著下降（P<0.01）,G2期细胞比例显著下降（P<0.05）,提示细胞阻滞在G0/G1期。相反,过表达DDR1能显著促进细胞增殖（P<0.05）,显著抑制细胞晚期凋亡（P<0.05）,G1期细胞比例极显著下降（P<0.01）,S期细胞比例极显著上升（P<0.01）,促进细胞由G1期向S期的转换。qRT-PCR检测结果显示,干扰DDR1后显著上调BAX、Caspase9基因的表达（P<0.05）,极显著上调P53、FAS基因的表达（P<0.01）,且显著下调PCNA、CyclinB1基因的表达（P<0.05）;过表达DDR1后,分别显著和极显著下调Cytc与BAX基因的表达（P<0.05,P<0.01）,并极显著上调CyclinB1基因的表达（P<0.01）。综上可见,DDR1能够调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖、凋亡和周期,可为阐明DDR1参与奶牛乳腺上皮细胞生长发育的分子机制提供参考。     

干扰PTEN基因对奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成相关基因的转录及脂肪酸组成的影响

旨在通过RNA干扰技术揭示蛋白酪氨酸磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）基因在奶山羊乳腺上皮细胞中对乳脂合成及脂肪酸组成的影响。利用RT-PCR方法扩增到西农萨能奶山羊乳腺组织中PTEN基因（GenBank登录号：MK158074.1）的CDS区，进行序列分析和不同泌乳时期差异转录分析。合成靶向该基因的siRNA，由RT-qPCR结果筛选出有效siRNA，将其转染至奶山羊的乳腺上皮细胞，进一步检测干扰该基因后对脂质合成相关基因转录水平及脂肪酸组成的影响。结果表明：本研究首次克隆到奶山羊（Capra hircus）PTEN基因的CDS区，全长为1 212 bp；经序列比对发现，山羊的PTEN基因核苷酸序列同牛（Bos taurus）、猪（Sus scrofa）和人（Homo sapiens）的相似度分别为99%、98%和97%，编码氨基酸序列相似性均在99%以上；蛋白质结构预测发现：其蛋白不存在跨膜结构域，亚细胞定位于细胞质中，N端具有保守的磷酸酶功能区；该基因在奶山羊泌乳盛期乳腺组织中的转录量较干奶期下降51.5%；合成的siRNA转染至乳腺上皮细胞后，成功筛选出理想的siRNA，干扰效率达到94%（P<0.01）；与对照组相比，干扰PTEN基因后显著上调SREBP1、FASN、ACACA、SCD1基因转录量（P<0.01或P<0.05），显著下调LPL、FABP3、ACOX1、CPT1B、GPAM、DGAT2和HSL基因转录量（P<0.01或P<0.05）。脂肪酸检测分析发现：干扰该基因能够显著上调C16：1的去饱和指数（P<0.05），但对C18：1的去饱和指数没有显著影响。综上所述，PTEN基因能够调控乳腺上皮细胞中脂质合成相关基因的转录及脂肪酸组成，在奶山羊乳脂代谢中发挥重要作用。     

牛肺炎链球菌重组PsaA蛋白对牛胚气管上皮细胞黏附抑制作用的研究

为研究牛肺炎链球菌的黏附蛋白—肺炎链球菌表面黏附素A (PsaA)对牛肺炎链球菌黏附牛胚气管上皮细胞的影响,本研究利用PCR扩增牛肺炎链球菌psaA基因,构建重组质粒pET32a-PsaA,经双酶切和测序鉴定正确后,将阳性重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和western blot鉴定重组PsaA蛋白(rPsaA)的表达情况及反应原性,结果显示,rPsaA在上清和沉淀中均获得了表达,且具有较好的反应原性。将牛胚气管上皮细胞与1.3×10⁸cfu/mL的牛肺炎链球菌稀释液于37℃共孵育后,利用间接免疫荧光试验(IFA)检测牛肺炎链球菌对牛胚气管上皮细胞的黏附性,结果显示,可观察到黏附在牛胚气管上皮细胞的牛肺炎链球菌的绿色荧光,即牛肺炎链球菌可以黏附牛胚气管上皮细胞。利用牛肺炎链球菌稀释液孵育经不同浓度rPsaA预处理的牛胚气管上皮细胞后,对黏附的细菌计数,结果显示,rPsaA可以极显著减少牛肺炎链球菌对牛胚气管上皮细胞的黏附菌数(P<0.01)。利用本研究制备的rPsaA多克隆抗体和肺炎链球菌阳性血清分别与牛肺...     

ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达与功能研究

旨在探究缺失、小的、同源异形1（absent，small，or homeotic 1-like，ASH1L）甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达与功能。本研究通过免疫荧光染色在健康母牛卵丘细胞中对ASH1L甲基转移酶进行定位，并分析细胞的组蛋白H3第36位赖氨酸（histone H3 lysine36，H3K36）甲基化修饰模式；合成靶向Ash1L基因的siRNA，对siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3及对照组进行荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹，筛选有效siRNA；采用荧光定量PCR分析干扰Ash1L表达对处理组及对照组中凋亡相关基因及多梳抑制复合体（polycomb repressive complex 2，PRC2）组成基因的表达水平的影响。结果显示，ASH1L甲基转移酶位于牛卵丘细胞的细胞核中，呈点状分布。成功筛选到能有效干扰牛Ash1L基因的siRNA-2，其干扰效率为60%~70%。将siRNA-2转染卵丘细胞后，该干扰组细胞中H3K36的单甲基化、二甲基化及三甲基化3种甲基化水平均显著低于对照组（P<0.05）；干扰Ash1L导致凋亡相关基因Bax、Bcl-2及caspase-3表达水平显著上调，凋亡基因Bax和caspase-3表达量高于抗凋亡相关基因Bcl-2（1.311和1.179 vs 1.146）；同时，干扰Ash1L基因表达也引起PRC2蛋白亚基EZH2和Suz12基因的mRNA表达量显著升高（P<0.05）。综上所述，本研究探讨了ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达和功能，ASH1L在牛卵丘细胞中呈点状分布，且Ash1L基因的抑制导致H3K36me1/2/3水平均显著下降及凋亡基因和PRC2蛋白相关亚基EZH2和Suz12基因表达的升高，为进一步研究其对家畜胚胎的调控作用提供技术和理论基础。     

精氨酸对干扰素-tau处理牛子宫内膜上皮细胞基因表达的影响

试验旨在研究精氨酸（Arg）对干扰素-tau（interferon-tau,IFNT）处理的牛子宫内膜上皮细胞的调控作用及其可能的机制。将牛子宫内膜上皮细胞接种至6孔细胞培养板中,当达到70%~80%融合度时,向细胞培养基中加入不同浓度的IFNT（0、100 ng/mL）,12 h后收集细胞检测未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）通路相关基因的表达情况;用不同浓度（0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mmol/L）Arg处理牛子宫内膜上皮细胞,24 h后用CCK8法检测其对增殖率的影响,筛选出Arg的最佳作用浓度;将子宫内膜上皮细胞随机分为Arg饥饿组、Arg饥饿+IFNT处理组、Arg添加+IFNT处理组,在Arg饥饿或添加处理6 h后加入100 ng/mL IFNT,IFNT处理12 h后检测UPR通路（BiP、PERK、CHOP、ATF6）、凋亡（BAX、Caspase9）和容受性（HOXA10）相关基因表达情况。结果显示,IFNT刺激可诱导牛子宫内膜上皮细胞UPR通路相关基因BiP、PERK、CHOP、ATF6的表达显著上调;0.5 mmol/L Arg可显著提高牛子宫内膜上皮细胞的增殖率（P<0.05）;Arg缺失可显著上调IFNT诱导下牛子宫内膜上皮细胞中BiP、PERK、CHOP、ATF6和BAX基因mRNA的表达（P<0.05）,并显著下调HOXA10基因mRNA的表达（P<0.05）,但对Caspase9基因mRNA表达无显著影响（P>0.05）。结果表明,Arg缺失可导致牛子宫内膜上皮细胞发生内质网应激,并影响子宫内膜宫受性的建立,可为进一步揭示Arg对牛子宫内膜的调控机制及制定减少妊娠早期胚胎丢失的营养调控策略提供参考。     

金黄色葡萄球菌表面蛋白A对奶牛乳腺上皮细胞的黏附作用

本试验拟探究金黄色葡萄球菌（金葡菌）表面蛋白A（Staphylococcus aureus surface protein A，SasA）编码基因在奶牛乳源金葡菌中是否具有普遍性及同源性，并结合蛋白结构组成研究SasA对奶牛乳腺上皮细胞的黏附作用。试验前期从中国北方5个荷斯坦牛场无菌条件下分离纯化了73株奶牛乳源金黄色葡萄球菌菌株，PCR扩增鉴定SasA基因并进行序列保守性分析。利用原核表达系统表达SasA蛋白的丝氨酸富集片段1（serine-rich repeat region 1， SRR1）及非重复区域（non-repeat region， NRR）并进行蛋白纯化。利用流式细胞仪检测NRR，牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）及SRR1对奶牛乳腺上皮细胞（Mac-T）黏附性差异。为进一步在NRR中定位发挥主要黏附作用的片段，试验采用了长度不同的NRR片段与完整NRR片段做竞争性黏附处理。PCR扩增产物鉴定及序列同源性分析结果显示，86.3%的牛源金葡菌菌株含SasA基因且序列一致性超过95%。相较于SRR1和BSA，NRR对细胞具有更强的黏附性。黏附抑制试验结果表明，NRR1-2片段（230—540 aa）对NRR抑制作用最明显。综上表明，SasA基因在奶牛乳源金葡菌中具有普遍性，该基因序列具有高度的保守性。在SasA蛋白中，对奶牛乳腺上皮细胞起主要黏附作用的为NRR1-2片段，大致定位在其结构域的230—540位氨基酸。本研究结果表明，与该区域结合的受体中可能存在SasA作为黏附素与奶牛乳腺上皮细胞互作的位点。     

干扰CREB基因对奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成相关基因表达及甘油三酯合成的影响

旨在筛选奶山羊cAMP应答元件结合蛋白CREB（cAMP response element binding protein）基因的siRNA,揭示干扰该基因后对乳腺上皮细胞中乳脂合成相关基因表达及甘油三酯合成的影响。本研究通过qRT-PCR方法从西农萨能奶山羊乳腺组织中扩增CREB基因完整的CDS区,进行序列分析和不同泌乳时期表达水平分析,合成靶向CREB基因的siRNA,利用荧光定量PCR筛选有效siRNA,并检测脂质合成相关基因的表达,采用试剂盒检测细胞内甘油三酯含量。结果表明：1）克隆得到全长为984 bp的奶山羊CREB基因的CDS区（GenBank登录号：MK158073）,并对其进行生物信息学分析。2）该基因在奶山羊泌乳盛期乳腺组织的表达量为干奶期的1.93倍（P<0.05）。3）成功筛选到靶向CREB基因的有效siRNA,干扰效率为72%（P<0.01）;并将其在奶山羊乳腺上皮细胞进行转染,通过qRT-PCR检测脂质合成相关基因的表达,与对照组相比,干扰CREB基因后显著抑制了FASN、ACACA、SCD1、FABP3、LPL、CPT1B、GPAM和DGAT2基因表达量（P<0.05）,并显著增加了HSL基因表达量（P<0.05）;且细胞内甘油三酯含量被显著下调（P<0.05）。综上所述,CREB基因在奶山羊原代乳腺上皮细胞中很可能通过调控脂质代谢相关基因的表达及甘油三酯含量对山羊的乳脂合成过程发挥重要作用。     

Prokaryotic Expression and Immunogenicity Analysis of Hemagglutinin-related Outer Membrane Protein from F.necrophorum

In order to analyze the immunogenicity of 120 ku hemagglutinin-related outer membrane protein from F.necrophorum,specific primers were designed to amplify the 3 truncated overlapping gene fragments covering the whole open reading frame (ORF) based on the result of antigenic epitope analysis.The gene fragments were ligated into the prokaryotic expression vector to construct pET-28a-p1,pET-32a-p2 and pET-32a-p3,respectively.Then recombinant plasmid was induced expression in E.coli.The SDS-PAGE results showed that the expression of recombinant proteins P1,P2 and P3,molecular mass of the expressed proteins were about 48,59 and 62 ku,respectively.Western blotting indicated that the recombinant proteins could be recognized by antiserum against F.necrophorum from mouse.Humoral immunity response against recombinant proteins was detected in the immunized rabbits.Altogether,these findings suggested that 120 ku hemagglutinin-related outer membrane protein from F.necrophorum had good immunogenicity,and this study provided a reference for further research on genetic engineering subunit vaccine of F.necrophorum.     

Effects of Interference and Overexpression of DDR1 on Proliferation and Apoptosis of Mammary Epithelial Cells in Dairy Cows

The aim of this study was to investigate the effect of discoidin domain receptor 1 (DDR1) gene on the proliferation, apoptosis and cell cycle of dairy cow mammary epithelial cells through interfering and overexpressing DDR1. The small RNA interference fragment of DDR1 gene and overexpression vector pcDNA3.1-DDR1 were transfected into dairy cow mammary epithelial cells, qRT-PCR and Western blot were used to detect the interference and overexpression efficiency of DDR1; CCK-8 was employed to detect cell proliferation; Flow cytometry was performed to detect the changes of cell cycle and apoptosis (early apoptosis and late apoptosis). qRT-PCR was used to detect the expression of genes related to proliferation and apoptosis. After interfering DDR1 gene in dairy cow mammary epithelial cells, mRNA and protein expression levels of DDR1 were down-regulated by 94% and 30%, respectively; While after overexpressing DDR1 gene, its mRNA and protein expression were up-regulated 68.24 and 1.38 times, respectively. Interfering DDR1 extremely significantly inhibited the proliferation of cells (P<0.01), the ratio of early and late apoptotic cells was extremely significantly increased (P<0.01); the ratio of G1 phase cells in the interference group was extremely significantly increased (P<0.01), and the proportions of S and G2 phase cells were significantly decreased (P<0.01 and P<0.05), which suggested that the cells were blocked in G0/G1 phase. Conversely, overexpression of DDR1 could significantly promote cell proliferation (P<0.05), significantly inhibit the late apoptosis of cells (P<0.05), the proportion of G1 phase cells was extremely significantly decreased (P<0.01), and the proportion of S phase cells was extremely significantly increased (P<0.01), suggesting the enhancement of transition from G1 to S phase. The results of qRT-PCR detection showed that after interfering DDR1, the expressions of BAX and Caspase9 genes were significantly up-regulated (P<0.05), and the expressions of P53 and FAS genes were extremely significantly up-regulated (P<0.01), while the expressions of PCNA and CyclinB1 genes were significantly down-regulated (P<0.05). After overexpression of DDR1, the expressions of Cytc and BAX genes were significantly (P<0.05) and extremely significantly down-regulated(P<0.01), respectively, and the expression of CyclinB1 gene was extremely significantly up-regulated (P<0.01). In summary, DDR1 can regulate the proliferation, apoptosis and cycle of dairy cow mammary epithelial cells, this result will provide a reference for elucidating the molecular mechanism of DDR1 involved in the growth and development of dairy cow mammary epithelial cells.     

DDR1基因过表达对水牛乳腺上皮细胞的影响

为揭示盘状结构域受体1（discoidin domain receptor1,DDR1）基因对水牛泌乳性能的影响,本研究构建了水牛DDR1基因真核表达载体,并对其最佳转染时间进行摸索,同时分析DDR1基因过表达对水牛乳腺上皮细胞的影响。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,载体片段大小与目标载体片段大小一致,均为8.8 kb,测序结果显示其与目的片段序列匹配率为100%。细胞转染试验结果显示,DDR1基因过表达最佳转染时间为48 h。细胞增殖检测结果显示,DDR1基因过表达组与对照组细胞相对荧光值差异不显著（P>0.05）。细胞凋亡检测结果显示,DDR1基因过表达对水牛乳腺上皮细胞的晚期凋亡率（19.87% VS 17.49%）无影响（P>0.05）,但极显著增加了水牛乳腺上皮细胞早期凋亡率（6.48% VS 1.35%,P<0.01）。同时,DDR1基因过表达上调了水牛乳腺上皮细胞中抑凋亡基因BCL-2和XIAP的表达,而下调了促凋亡基因P53的表达。此外,DDR1基因过表达显著提高了水牛乳腺上皮细胞的迁移率（66.26% VS 58.76%,P<0.05）。综上,试验成功构建了水牛DDR1基因真核表达载体并证明了DDR1基因过表达促进了水牛乳腺上皮细胞的早期凋亡和迁移,为今后进一步研究水牛乳腺发育和泌乳性能提供了一定理论依据。