检测纽布病毒的Real-time RT-PCR方法的建立与应用

纽布病毒(nebovirus, NeV)是国内新发的犊牛腹泻病原,本试验目的是建立检测NeV的real-time RT-PCR方法。根据国内NeV流行株的聚合酶基因(RdRp)序列设计引物,通过反应条件和体系优化,成功建立基于TB Green检测NeV的real-time RT-PCR方法。结果显示:该方法在2.9×10~1～2.9×10~9copies·μL^-1之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R^2=0.999 4,扩增效率为98%;该方法只特异性检出NeV,不检出常见无关病原;最低检测下限为29 copies·μL^-1;批内和批间的变异系数分别为0.89%～1.89%和0.83%～1.15%;该方法对临床样本的检出率高于文献报道的三种检测方法(P<0.05)。对2018年8—11月采自新疆和辽宁的135份奶犊牛腹泻样本中NeV的检出率为67.41%,场阳性率为100%(15/15)。所建方法的特异性和稳定性好、灵敏度高,为NeV的检测和流行病学调查提供了有力的手段。     

引起犊牛腹泻的Nebovirus

Newbury-1 virus目前是杯状病毒科(Caliciviridae)纽布病毒属(Nebovirus)的唯一成员,常用Nebovirus(NeV)表述。NeV为单股正链RNA病毒,基因组全长为7 453～7 460 bp,是致犊牛腹泻的重要病毒。NeV的病原检测主要依靠RT-PCR和Real-time RT-PCR方法。迄今为止,NeV已经在美国、英国、巴西、土耳其等13个国家检出,具有广泛的地域分布。最近,本实验室的研究表明该病毒在我国奶牛和牦牛中广泛流行,具有独特的进化趋势,并且有新基因型毒株的出现。本文就NeV的生物学特性、流行概况、所致疾病的临床症状与病理变化、检测方法和防控措施等研究进展进行综述,以期为NeV的研究提供参考。     

引起犊牛腹泻的Nebovirus

Newbury-1 virus目前是杯状病毒科（Caliciviridae）纽布病毒属（Nebovirus）的唯一成员,常用Nebovirus（NeV）表述。NeV为单股正链RNA病毒,基因组全长为7 453~7 460 bp,是致犊牛腹泻的重要病毒。NeV的病原检测主要依靠RT-PCR和Real-time RT-PCR方法。迄今为止,NeV已经在美国、英国、巴西、土耳其等13个国家检出,具有广泛的地域分布。最近,本实验室的研究表明该病毒在我国奶牛和牦牛中广泛流行,具有独特的进化趋势,并且有新基因型毒株的出现。本文就NeV的生物学特性、流行概况、所致疾病的临床症状与病理变化、检测方法和防控措施等研究进展进行综述,以期为NeV的研究提供参考。     

新疆地区奶牛6种腹泻相关病毒的检测

为了解新疆地区奶牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、纽布病毒(NeV)、牛诺如病毒(BNoV)、牛库布病毒(BKV)的感染情况,用RT-PCR方法对采集自新疆昌吉和石河子等地区的10个奶牛场共计86份腹泻犊奶牛粪便样本进行分子流行病学调查。86份样品中,BRV检出率为60.5%(52/86),NeV检出率为51.2%(44/86),BKV检出率为39.5%(34/86),BCoV检出率为26.7%(23/86),BNoV检出率为12.8%(11/86),BVDV检出率为9.3%(8/86)。另外,腹泻粪便样本中BRV、BCoV、NeV、BNoV、BKV和BVDV混合感染严重。研究结果为新疆地区奶牛腹泻的综合防治提供了依据。     

猪Delta冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用

猪Delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均是能引起仔猪腹泻的冠状病毒,通过临床症状和剖检很难鉴别诊断,建立同时检测且能够鉴别诊断这3种疾病的快速检测方法对于临床诊断具有重要的意义。参照GenBank中登录的PDCoV,NPEDV M和TGEV N基因的基因序列,利用Primer5.0设计合成3对能扩增特异性目的片段的引物,构建重组质粒,并对RT-PCR反应条件进行优化,建立了检测PDCoV,PEDV和TGEV的多重RT-PCR诊断方法,并对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性分析。利用该方法对河南176份临床样品进行检测,并与普通RT-PCR检测方法对该检测方法进行比较分析。结果表明,所建立的三重RT-PCR方法对PDCoV的最低检测量是3.14×103拷贝/μL;PEDV的最低检测量是3.88×104拷贝/μL和TGEV的最低检测量是3.68×104拷贝/μL。所建立的方法具有较好的特异性,对猪博卡病毒(PboV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟(CSFV)和猪圆环病毒(PCV)等猪常见病毒的扩增结果均为阴性。应用所建立的三重RT-PCR方法对176份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV,PDCoV和TGEV检测,并将检测结果和单重RT-PCR检测方法比较,结果显示,多重RT-PCR检测结果与常规单一RT-PCR的结果符合率均为100%。综上,本试验建立了能同时检测PDCoV,PEDV和TGEV的三重RT-PCR方法,为临床上这3种疫病的快速检测和流行病学调查奠定了基础。     

水疱性口炎病毒荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立与应用

本研究建立荧光定量RT-PCR鉴别检测水疱性口炎病毒的方法。针对Gen Bank登录的水疱性口炎两血清型-新泽西型(VSV-NJ)和印第安纳型(VSV-IND)的L基因保守区,设计1对引物和2条探针。通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了Taq Man荧光定量RT-PCR快速检测VSV的方法。与常规RT-PCR试验比较表明,所建立的荧光RT-PCR检测技术快速、敏感,检测时限3 h以内,具有很好的特异性和重复性,可以实现水疱性口炎病毒的快速检测分型。通过对342份临床样品进行检测,结果表明,所建立的检测方法适用于样品中水疱性口炎病毒的直接检测。     

犊牛腹泻粪便样本中纽布病毒VP1和RNA依赖性RNA聚合酶基因的序列分析

纽布病毒（Nebovirus，NeV）是国内犊牛腹泻的新发病原，其VP1蛋白含有受体结合位点和中和抗原表位，与病毒的感染和免疫密切相关，本研究旨在分析VP1基因1.2型毒株的分子特征。采用RT-PCR方法，对2019年宁夏和河南的犊牛腹泻粪便样本进行NeV检测，扩增阳性样本完整的主要衣壳蛋白（VP1）和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）。结果显示，宁夏和河南地区NeV检出率分别为11.32%和8.62%。从4个样本中成功获得了1.2型毒株完整VP1和RdRp序列。4个完整VP1与GenBank中73个完整VP1的氨基酸相似性为75.4%~97.8%；与GenBank中仅有的3个1.2型VP1相比，4个毒株在P2区有1个共同的氨基酸突变，在P1区有2个共同的氨基酸突变。与国内基因1.1型、1.3型和1.4型毒株相比，在P2区分别有9、18和14个共同的氨基酸突变，在P1区分别有2个共同的氨基酸突变，在S区分别有1个共同的氨基酸突变。4个完整RdRp均为NB-like基因型，与GenBank中8个完整RdRp的核苷酸相似性为67.2%~94.8%。本文首次在我国检测到VP1基因1.2型毒株，成功获得了4条基因1.2型毒株的完整VP1和RdRp序列，为国内NeV的分子流行病学和遗传进化研究等提供了参考。     

猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速鉴别诊断方法,试验根据GenBank中已发表的PEDV和TGEV的相关基因序列,设计合成特异性引物,分别进行单项PCR最佳反应条件的摸索;确定最佳反应条件后建立PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测方法,并进行特异性分析;同时采用单项RT-PCR和二重RT-PCR法检测临床样本,比较两种方法的检出率。结果表明:试验成功建立了PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测方法,经最佳退火温度摸索,二重RT-PCR法的最佳退火温度为58.1℃;经特异性分析,二重RT-PCR法对PEDV和TGEV具有很好的特异性;临床样本的检测结果显示,二重RT-PCR法与单项RT-PCR法检出率基本吻合。说明试验建立的PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测方法可用于猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病的快速鉴别诊断。     

基于锁核酸探针的双重荧光实时RT-PCR检测方法鉴别新城疫中强毒株与弱毒株

为鉴别新城疫病毒(NDV)强毒株和弱毒株,本研究建立了基于新型锁核酸(LNA)探针的实时荧光RT-PCR检测方法(Duplex LNA rRT-PCR)。该方法针对NDVF基因裂解位点设计了两条新型LNA探针,通过对11株NDV株进行大将军脂duplex LNA rRT-PCR检测方法检测,验证该方法的特异性;通过对副粘病毒I型(APMV-1)和NDV中强毒株(vNDV)不同浓度病毒液进行检测,确定该方法的灵敏度,并与TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法进行比较。结果显示本研究所建立的方法对11株NDV检测的特异性为100%(11/11),优于TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法(10/11);所建立的duplex LNA rRT-PCR方法检测中强毒株F48E9和弱毒株LaSota的灵敏度分别为10个EID50和0.1个EID50,比美国农业部推荐的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法低10倍。本研究利用新型LNA探针技术,建立了鉴别NDV中强毒株与弱毒株的duplex LNA rRT-PCR检测方法,可以特异性检测NDV并有效区分中强毒株与弱毒株,适合用于鸡场和进出境动物产品中NDV的快速检测。     

猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

检测牛5种腹泻病毒的多重RT-PCR方法的建立及应用

牛A群轮状病毒(BRVA)、牛冠状病毒(BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛诺瓦病毒(BNoV)和牛纽布病毒(BNeV)是引起犊牛腹泻的常见病毒,且临床上多存在混合感染的情况.本试验的目的 是建立可以同时检测上述5种病毒的多重PCR方法.通过设计引物,优化反应体系和条件,成功建立了可同时检测BRVA、BCoV、...     

Molecular cloning of complementary DNA from a pneumopathic strain of bovine viral diarrhea virus and its diagnostic application.

A pneumopathic strain of bovine viral diarrhea virus was grown in cell culture and purified. Genomic ribonucleic acid was extracted, polyadenylated at the 3' end, and copied into complementary DNA after oligo-dT priming. Complementary DNA was male double stranded and cloned into the pUC9 plasmid. Approximately 200 complementary DNA clones varying in length from 0.5 to 2.5 kilobases were obtained. Hybridization assays indicated that the sequences isolated were specific for bovine viral diarrhea virus and that at least 5.5 kilobases of bovine viral diarrhea virus genome was represented in the library of complementary DNA clones, the majority of which may have originated from the 3' end of the virus genome. One cloned complementary DNA sequence was used as a 32P-labelled hybridization probe for bovine viral diarrhea virus detection. The probe hybridized with all cytopathic and noncytopathic strains of bovine viral diarrhea virus tested and was 100 times more sensitive than infectivity assays for the detection of bovine viral diarrhea virus. Hybridization did not occur with nucleic acids from bovine coronavirus, bluetongue virus, bovine adenovirus or uninfected cell cultures. Native plasmid DNA sequences, labelled with 32P, did not hybridize with bovine viral diarrhea virus ribonucleic acid.     

Establishment and Preliminary Application of Nano-PCR and LAMP Methods for Bovine Parainfluenza Type-3 Virus

This study was aimed to establish Nano-PCR and LAMP which were new rapid type of molecular detection technologies of bovine parainfluenza type-3 virus (BPIV3).The comparative specificity and sensitivity of BPIV3 Nano-PCR and LAMP PCR were tested, and the assay was applied to detect 10 clinical samples. The specificity and sensitivity tests showed that Nano-PCR and LAMP were only sensitive to BPIV3,without cross reaction to other viruses, such as bovine respiratory syncytial virus,infectious bovine rhinotracheitis virus and bovine viral diarrhea virus. In the sensitivity test, Nano-PCR and LAMP showed 10 times sensitivity than that of the traditional PCR technology,with the minimum detection of 4.16×10² copies/μL. Clinical test results showed that the coincidence rate of Nano-PCR and LAMP could reach to 100%, and the positive detection rate was much higher than that of normal PCR.Therefore, the Nano-PCR and LAMP methods established in this study provided a faster, sensitive and reliable tool for the clinical diagnosis of BPIV3.     

牛副流感3型病毒Nano-PCR、LAMP方法的建立及初步应用

试验旨在建立牛副流感3型病毒（bovine parainfluenza type-3 virus,BPIV3）纳米PCR（Nano-PCR）与环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）新型快速分子检测技术,对其进行特异性和敏感性对比试验,并对10份临床样品进行了检测。特异性与敏感性试验结果显示,建立的Nano-PCR和LAMP方法只对BPIV3特异,而对牛呼吸道合胞体病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒无交叉反应;建立的Nano-PCR和LAMP方法具有相同的敏感性,均是普通PCR的10倍,最低核酸检出量均为4.16×10²拷贝/μL。临床检测结果显示,建立的两种方法阳性符合率为100%,且阳性检出率均高于普通PCR。因此,本试验建立的Nano-PCR和LAMP方法为BPIV3的临床诊断提供了更快速、敏感、可靠的工具。     

一株源于商品胎牛血清的BVDV-2型的分离鉴定及基因组序列分析

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是引起牛病毒性腹泻/黏膜病的重要病原,也是牛血清及其制品污染中的常见病原体。本研究从商品化胎牛血清中分离到一株致细胞病变（CP）型BVDV（GS2018株）,利用电镜观察、免疫荧光检测、分子鉴定、基因组测序及遗传进化分析对其进行鉴定。结果表明,GS2018株接种MDBK细胞后可见明显的细胞病变（CPE）,培养第4天病毒滴度达1×10^6.2·0.1 mL^-1。病毒粒子呈圆形,直径为50~60 nm,间接免疫荧光检测为阳性;其5'UTR扩增片段与BVDV-2相应序列高度相似,病毒基因组包含12 235个核苷酸（nt）。5'UTR、N^pro及E2基因系统进化分析发现,GS2018株与美国BVDV-2 USMARC-60764分离株核苷酸一致性达98%,证明其属于CP型BVDV-2a亚型。但GS2018株在NS2/3区无核酸片段插入,这与大多数CP型BVDV-2明显不同,说明BVDV致细胞病变可能涉及更复杂的机制。     

Development and evaluation of a novel antigen capture assay for the detection of classical swine fever virus antigens

An antigen-capture enzyme immunoassay (EIA) was developed to detect classical swine fever virus (CSFV) antigen directly from 10% w/v tissue suspension. The assay, based on the sandwich principle, uses a biotinylated monoclonal antibody bound to streptavidin-coated microplates as the capture system and a swine anti-CSFV antibody and rabbit anti-swine HRPO-conjugate as the detector system. The antigen-capture EIA was compared with conventional virus isolation and polymerase chain reaction (PCR) for detection of CSFV in tissues. The ability of the antigen-capture EIA to discriminate classical swine fever (CSF) from bovine viral diarrhea and African swine fever viruses was also tested. The assay was shown to detect 21 different strains of CSFV and was unreactive with tissues from uninfected animals. Signal to noise (S/N) ratios were calculated from the EIA absorbance values. Readings from samples positive by virus isolation (n=47) averaged a S/N ratio of 5.34. In contrast, samples negative by virus isolation (n=96) demonstrated a mean S/N ratio of 0.16. At S/N cut-off value of 1.0, all samples that yield virus isolation and PCR negative result were negative in the antigen-capture EIA. Compared with virus propagation in tissue culture using PK15 cells (followed by indirect peroxidase assay detection) and PCR, the EIA had a specificity of 98.7% and a sensitivity of 91.4%. The EIA is simple, can be performed in 4 h and lends itself to automation for screening of tissues sample from pigs suspected of CSFV infection.     

青海省部分地区3种牛病毒性腹泻病原的感染情况调查

为了解青海省部分牛群中牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）、牛轮状病毒（bovine rotavirus,BRV）和牛冠状病毒（bovine coronavirus,BCV）3种牛病毒性腹泻病原的感染现状,本研究采用RT-PCR方法首次对2012～2013年青海省部分地区的32份具有腹泻症状的临床病料及152份健康牛粪便样品进行了BVDV、BRV、BCV的核酸检测与分析。结果显示,32份腹泻牛病料样品中BVDV、BRV、BCV的阳性率分别为65.63%（21/32）、18.75%（6/32）、34.38%（11/32）,且存在2种或3种病原的混合感染;152份健康牛粪便样品中BVDV、BRV、BCV的阳性率分别为3.95%（6/152）、1.97%（3/152）、0（0/152）。该结果表明青海省部分牛群中普遍存在BVDV、BRV、BCV的感染,且混合感染现象严重,需进一步加强青海省地区牛病毒性腹泻病原的综合防控。     

Establishment and Application of Duplex RT-PCR Assay for Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus and Pseudorabies Virus

In order to establish an assay for detecting porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) and pseudorabies virus (PRV),two pairs of primers were designed basing on the M gene of PEDV and gE gene of PRV,respectively.The total RNA of standard PEDV and PRV strains were used as templates to establish the duplex RT-PCR assay.The specificity,sensitivity,repetition and clinic detection of the established assay were tested.The result revealed that the threshold of duplex RT-PCR was 10 TCID₅₀/mL of PEDV and PRV,and no products were amplified from the cell or the nucleic acid of other 7 kinds of pathogenic viral or bacterial microorganism.The detection results for 26 clinical suspicious PEDV or PRV infected pigs were consistent with the results tested by sequencing.This study suggested that the duplex RT-PCR method was highly specific,repeatable and sensitive,and was suitable for clinic rapid differential diagnosis of PEDV and PRV.     

猪流行性腹泻病毒与猪伪狂犬病病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）与猪伪狂犬病病毒（PRV）的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank已登录的PEDV膜蛋白M基因和PRV gE基因保守区域序列设计了2对特异性引物,以PRV和PEDV混合总RNA为反转录模板,初步建立了PRV和PEDV的二重RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性验证和临床应用检测。结果显示,该方法对两种病毒的最低检测限均为10 TCID₅₀/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增PEDV和PRV细胞培养物,但对其他7种病原对照扩增不出任何条带,对26份临床疑似PEDV和PRV感染样品检测结果与测序鉴定结果完全一致。本研究成功建立了PEDV和PRV的二重RT-PCR检测方法,为临床上猪流行性腹泻和猪伪狂犬病的快速鉴别诊断提供了方法。