虾夷马粪海胆体腔液中调理素样分子的研究

为研究虾夷马粪海胆体液免疫机理,测定其体腔液吞噬细胞在不同介质中对不同处理的酵母细胞的吞噬作用。对其无细胞体腔液、从调理及非调理酵母细胞分离出的成分进行SDS-PAGE分析,同时对无细胞体腔液进行透析、SephadexG-200凝胶层析和SDS-PAGE分析,在等渗缓冲液和酵母细胞吸附的无细胞体腔液中,测定不同调理素样分子浓度和不同反应时间时吞噬率的变化。结果显示,吞噬细胞在3种介质:等渗缓冲液、酵母细胞吸附的无细胞体腔液和无细胞体腔液中对非调理酵母细胞吞噬率之比为1.00∶1.11∶1.94,在等渗溶液中对调理酵母细胞的吞噬率是非调理酵母细胞的1.61倍;从调理酵母细胞分离出的成分在SDSPAGE中显示一条调理素样分子带,分子量为250.62 ku。经透析和SephadexG-200凝胶层析后,测得纯化的调理素样分子的分子量为250.62 ku;在所测试的浓度范围内,调理素样分子浓度越大,吞噬活性越高,且5.0和10.0μg/mL组在各个测试时间均比对照组高。在等渗缓冲液中,反应30 min时,10.0和5.0μg/mL组与对照组均有极显著差异(P0.01),在酵母细胞吸附的无细胞体腔液中,反应30 min时,10.0μg/mL组与对照组有显著差异(P0.05)。结果表明,在虾夷马粪海胆体腔液中发现一种调理素样分子,分子量约为250.62 ku,一定浓度的调理素样分子能显著提高虾夷马粪海胆体腔液吞噬细胞的吞噬活性。     

患“红斑综合征”的海胆体腔液中菌群结构特征

为探究患“红斑综合征”海胆的细菌群落结构、功能，以及该病在海胆种间的传播性，采用16S r DNA高通量测序技术人工回归感染，从患病马粪海胆（Hemicentrotus pulcherrimus）体腔内分离、鉴定出一株灿烂弧菌（Vibrio splendidus），之后配置其菌悬液注射到光棘球海胆（Strongylocentrotus nudus）、中间球海胆（Strongylocentrotus intermedius）和海刺猬（Glyptocidaris crenularis）体腔内，构建海胆感染“红斑综合征”后体腔液菌群16S r RNA基因测序文库，分析不同种类海胆感染“红斑综合征”后体腔内菌群结构。结果显示：光棘球海胆、中间球海胆、海刺猬均可被灿烂弧菌感染，出现“红斑”病征，在10 d内均死亡，其中中间球海胆表现出围口膜周围变黑，体壁出现红色斑块；光棘球海胆体腔液变为紫黑色等。3种海胆注射感染后体腔液内优势菌门均为变形菌门（Proteobacteria），所占比例分别为99.94%、60.18%和92.38%；弧菌属（Vibrio）为优势菌属，所占比例分别上升到99.90%、...     

不同种海胆体腔细胞类型及体液中的酶活力

以中国主要经济海胆马粪海胆(Hemicentrotus Pulcherrimus)、虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)、光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus)、紫海胆(Anthocidaris crassispina)以及杂交种海胆-马粪海胆(♀)×虾夷马粪海胆(♂)、虾夷马粪海胆(♀)×光棘球海胆(♂)、马粪海胆(♀)×紫海胆(♂)和紫海胆(♀)×光棘球海胆(♂)为对象,进行海胆的血细胞及体液中酶活力的研究。结果表明,海胆血细胞可分为4类,分别为色素细胞、纤毛游走细胞、变形吞噬细胞和无色球形细胞,比例分别为4.56%~10.96%、9.69%~12.18%、76.40%~85.36%和0.35%~1.03%;海胆血细胞体外有凝聚和吞噬现象。不同种海胆体液中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶(LSZ)的酶活力测定结果显示,紫海胆血清中各种酶的活性都较高,其中碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性在6种海胆中都是最高的,分别为2.871 U/mg和182.149 U/mL。马粪海胆(♀)×虾夷马粪海胆(♂)的溶菌酶活性最高,为0.085 U/mL;虾夷马粪海胆(♀)×光棘球海胆(♂)的酸性磷酸酶活性最高,为1.070 U/mg,但差异均不显著(P>0.05)。[中国水产科学,2006,13(1):33-38]     

虾夷马粪海胆体腔细胞的类型及功能

取平均壳径分别为1．9cm和4．4cm虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)进行实验观察。结果表明，海胆体腔有2种类型的细胞，即变形吞噬细胞和色素细胞。变形吞噬细胞形状不定，能伸出伪足，核较大，线粒体、溶酶体等细胞器丰富。色素细胞具突起，内有紫红色颗粒，颗粒溶于酒精等多种溶剂中，使得电镜下细胞内含有大量空泡，细胞核很少见，细胞器较少。变形细胞离体后可凝集，具吞噬酵母的能力，吞噬能力与温度成正相关。色素细胞具有辅助的免疫功能。     

光棘球海胆与虾夷马粪海胆摄食与吸收的初步研究

在同等摄食条件下,虾民粪海胆的生长明显快于光棘球海胆;虾夷马粪海胆的平均日摄食率,粗同化率高于光棘球海胆;     

中间球海胆体腔细胞损失后的恢复规律及恢复期中轴器观察

本研究通过人工抽离中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)体质量10%的体腔液诱导体腔细胞的修复更新,分组测定6、12、18和24 h后海胆围脏腔内的体腔细胞密度,分析体腔细胞的修复规律;同时,取各时间点海胆的中轴器进行组织学观察,并利用鼠抗人Ki-67(细胞增殖抗原)单克隆抗体检测中轴器内的细胞增殖信号。结果显示,人工抽离体腔液后6 h,体腔细胞密度与初始密度相比明显偏低;12 h后逐步升高,密度略低于初始密度,恢复度为(92.78±29.40)%;18 h后已明显高于初始密度,恢复度为(137.08±32.40)%,显著高于6 h和12 h的恢复度(P<0.05),随后,体腔细胞密度逐渐降低。海胆损失体腔液后,中轴器表现为内部组织消减、空腔化,外壁上皮细胞层崩解、脱离,凸起结构空泡化等变化,18 h后内部疏松组织略有增加,24 h后中央腔内出现明显的新生组织。利用Ki-67单克隆抗体检测发现,正常海胆中轴器内具有一定的细胞增殖信号,该信号在损失体腔细胞18 h后明显增强。结果表明,损失体腔细胞后,中间球海胆可启动快速恢复机制,而海胆的中轴器发生明显的组织结构变化,组织内的细胞增殖活动也明显增强。研究结果可为海胆体腔细胞的造血组织与发生机制研究提供依据。     

5种重金属对光棘球海胆胚胎的毒性作用

采用静态毒性试验方法,在水温(21±0.5)℃、盐度32条件下,研究Zn、Hg、Cu、Pb、Cd单独暴露对光棘球海胆的精卵结合和胚胎发育的毒性作用。观察了5种重金属对光棘球海胆精子超微结构的损伤。试验结果表明,3个暴露浓度下,5种重金属均可导致光棘球海胆受精率极显著下降,胚胎延滞率和胚胎畸形率极显著上升,并呈剂量—效应关系。5种重金属对海胆精子细胞超微结构的损伤,可能是导致海胆受精率降低、胚胎延滞率和畸形率升高的原因之一。     

四种海胆杂交的可行性及子代的早期发育

报道了中国北部沿海马粪海胆、海刺猬、光棘球海胆三种主要海胆与引自日本的中间球海胆四种海胆之间的不同组合的杂交试验及其子代浮游幼体及幼海胆的早期生长发育.结果表明,采用生殖调控可使不同海胆达到同步繁殖,在8～24℃下各种海胆杂交组合的受精率与亲本亲缘关系有关,同时受到双亲繁殖适宜温度的影响,受精率介于0～69.6%之间,均低于自交组.以马粪海胆和海刺猬为亲本的正反交、以马粪海胆和中间球海胆为亲本的正反交以及马粪海胆()×光棘球海胆()各组杂交胚胎均可发育至四腕幼虫,但畸形率较高,浮游时间比自交组延长3～10d,在其中的3个杂交组得到了幼海胆,经过14个月的室内培育,杂交组成活率低于自交组,壳直径达2.59～2.88cin.     

二价金属离子对光棘球海胆免疫相关酶活力的影响

二价金属离子在海洋无脊椎动物免疫相关酶的活力调控中发挥重要作用。为了解二价金属离子对光棘球海胆免疫相关酶活力的影响,采用生化方法研究了8种二价金属离子在体外不同浓度下对光棘球海胆体腔液中酸/碱性磷酸酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、酚氧化酶和髓过氧化物酶活力的影响。结果显示,Cu~(2+)可明显增强碱性磷酸酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶的活力;Mn~(2+)对酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶和髓过氧化物酶有强烈的激活作用;Zn~(2+)对超氧化物歧化酶和酚氧化酶有强烈的抑制作用;Fe~(2+)抑制过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活力;Ca~(2+)对酸性磷酸酶和髓过氧化物酶有抑制作用;Mg~(2+)对碱性磷酸酶有抑制作用;Cd~(2+)对超氧化物歧化酶和酚氧化酶有抑制作用;Pb~(2+)对过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶有抑制作用。试验结果表明,适宜浓度的Mn~(2+)和Cu~(2+)对光棘球海胆的非特异性免疫系统可能有促进作用,而Fe~(2+)、Zn~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Pb~(2+)和Cd~(2+)可能会削弱光棘球海胆的免疫应答能力。     

中间球海胆乳酸脱氢酶基因克隆及其对海水酸化的响应

为明确中间球海胆乳酸脱氢酶(LDH)基因序列及表达特征,研究其对海水酸化胁迫的响应,实验利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得中间球海胆LDH基因(命名为SiLDH)的全长cDNA,并且比较了海水酸化胁迫下,中间球海胆不同组织SiLDH基因表达及总LDH活性的变化情况。结果显示:①SiLDH基因的cDNA全长为1 499 bp,包含133 bp的5′非编码区,349 bp的3′非编码区和1 017 bp编码338个氨基酸的开放阅读框(ORF)。SiLDH编码蛋白的相对分子量为36.40 ku,理论等电点为6.55,属于无信号肽的非跨膜、温和疏水蛋白。②生物信息学分析显示,SiLDH蛋白序列与紫球海胆LDH X4蛋白序列一致性最高(90.88%)。③实时荧光定量PCR(qRT-PCR)发现,SiLDH基因在检测的4种组织中均有表达,相对表达量从高到低为性腺管足肠体腔液;总LDH活性检测显示,中间球海胆总LDH活性从高到低为性腺管足体腔液肠;④海水酸化处理60 d后发现,与自然海水组(pH 8.06±0.01)相比,SiLDH基因在中间球海胆性腺、管足和肠道中呈现总体降低趋势,在体腔液中则呈现随海水pH降低先降低后显著升高的趋势;总LDH活性在性腺、管足和体腔液中呈现随海水pH降低而降低的趋势,在肠道中则呈现随海水pH降低先降低后显著升高的趋势。研究表明,中间球海胆面对海水酸化时可能通过调节SiLDH基因的表达和LDH活性来缓解海水酸化带来的负面影响。     

利用cDNA-AFLP技术筛选与海胆数量性状相关显著的分子标记

以光棘球海胆(♀)×中间球海胆(♂)的F1代为材料,利用cDNA-AFLP技术,采用单因素方差分析方法,对与海胆壳径、体质量和生殖腺质量等主要经济性状相关的分子标记进行筛选,并对这些数量性状与分子标记的相关性进行分析.结果表明,10对引物共筛选出与壳径、体质量、生殖腺质量显著相关cDNA-AFLP标记数分别为43、48和42个;极显著相关cDNA-AFLP标记数分别为38、38和23个;与3个数量性状相关显著的分子标记贡献率分别为7.62%～12.48%、8.02%～14.15%和7.94%～13.71%;相关极显著的分子标记贡献率分别为15.36%～34.55%、11.88%～39.88%和13.39%～32.26%.     

Cu2+对中间球海胆生长、免疫及性腺发育的影响

为探讨铜离子(Cu2+)对中间球海胆生长和性腺发育的影响及调控机制,在室内水槽(200 L)中进行为期60 d的浸泡实验。实验设置测试组(0.02 mg/L Cu2+)和对照组(自然海水),每个处理设置3个重复,每个水槽养殖20只海胆(13.58±0.79)g。实验中期和末期分别测定海胆增重率(WGR)、性腺指数(GI)、抗氧化酶活性和主要卵黄蛋白基因(MYP)表达量。结果显示,30 d时,测试组的WGR和GI与对照组差异不显著,而60 d时测试组的WGR和GI显著低于对照组;60 d时,测试组海胆体腔液中过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽巯基转移酶(GST)活性均显著低于30 d时的对应值,而丙二醛(MDA)含量较30 d时有所升高;60 d时,测试组抗氧化能力总体高于对照组,其中体腔液中CAT活性显著高于对照组。2次取样中,测试组性腺中MYP基因的表达量均显著低于对照组,而测试组消化道中MYP基因的表达量却显著高于对照组。60 d时,测试组海胆体腔细胞中总蛋白含量显著高于对照组,而体腔液上清液中总蛋白含量在测试组和对照组之间差异不显著。研究表明,铜离子能够引起氧化应激,降低海胆的增重率和性腺指数,这可能是通过抑制性腺MYP表达量及阻碍MYP从消化道向性腺正常转运所致。     

温度、盐度和pH对仿刺参体腔细胞活性氧产生的影响

无脊椎动物主要依靠天然免疫进行自身防御,而活性氧在保护宿主免受病原侵害方面发挥重要作用。本文研究了环境因子温度,盐度和pH对仿刺参体腔细胞吞噬过程中活性氧产生的影响。不同环境条件处理暂养7d的仿刺参,于不同时间点抽取体腔液,然后用鲁米诺化学发光法检测仿刺参体腔细胞体外吞噬酵母细胞时活性氧的产生。试验结果表明,与对照组相比(17℃),6℃和26℃水温中的仿刺参分别从第1d和第15d极大地增加了活性氧的产生。盐度25和盐度35两组仿刺参体腔细胞比对照组吞噬过程产生更多的活性氧,而盐度16和40两组第1d时活性氧的产生亦显著增强。较低pH同样极大增强了吞噬作用中活性氧的产生。研究结果表明,温度、盐度和pH均可影响仿刺参体腔细胞吞噬过程中活性氧的产生。该试验为进一步研究仿刺参在适应不同环境时的生理生化过程及无脊椎动物免疫机制奠定了基础。     

光棘球海胆与仿刺参混养技术初步探讨

<正>光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus),又称为大连紫海胆,属棘皮动物门、球海胆属,是海洋里比较常见的一类无脊椎动物,产于西北太平洋沿岸,是我国海胆类中经济价值最高的土著种,主要分布在辽东和山东半岛以及渤海的部分岛屿,其生殖腺色泽鲜美,口感极佳,是我国北方重要的出口海珍品[1]。刺参(Apostichopus japonicus)属棘皮动物门、仿刺参属,是温带种,自然分布主要在北太平洋沿岸,包括我国的黄、渤海沿岸,在我国主要分布于辽宁大连、山东及江苏北部等沿海地区[2]。据记载,在我     

刺参体腔液穿刺抽取后细胞恢复过程的初步研究

通过所绘制的刺参沥水后体质量变化曲线得出,在气温20℃以下,刺参沥水后20～30min为测量刺参体质量的最佳时机。利用重量差值法得出刺参体腔液占体质量的百分比分别是:小参26.88±1.39%、中参25.24±2.91%、大参30.98±1.86%。通过检测刺参体腔液抽取后刺参生理状态的变化得出刺参体腔液单次安全抽取量为体质量的1.5%以内。通过检测单次抽取刺参体腔液后其体腔液中总细胞、透明细胞及淋巴样细胞和颗粒细胞数量的恢复过程得出,刺参不同类型的体腔细胞在受抽取刺激后恢复过程也不是同步进行的,体腔液总细胞浓度恢复时间间隔为4d,颗粒细胞、透明细胞及淋巴样细胞浓度恢复时间间隔为6d,体腔液吸光值恢复时间间隔为5d,由此得出,在进行多次抽取体腔液时建议至少间隔6d以上。研究建立的刺参体质量测量方法和所确定刺参体腔液基础指标为进一步开展刺参免疫学、生理学、动物学试验等研究提供参考和基础性数据。     

中间球海胆Y-box基因分子特性和表达分析

为获得Y-box蛋白在中间球海胆的生物学功能,实验克隆了中间球海胆Y-box基因的全长cDNA,并进行了定量表达模式分析.Y-box基因全长cDNA为2 425 bp,该序列具有一个81 bp的5’非编码区,1 348 bp 3’非编码区,ORF为996 bp,cDNA编码331个氨基酸的前体蛋白,预测蛋白分子质量为37.4 ku,理论等电点是8.55,属于亲水性蛋白.中间球海胆Y-box前体蛋白的氨基酸序列包含3个结构域:氨基酸N末端,亲水结构域C末端和冷休克结构域(cold shock domain CSD),其中CSD区为Y-box蛋白家族中保守结构域.海胆Y-box蛋白质二级结构中无规则卷曲占88.22％,延伸链占9.97％,α-螺旋1.98％,无β-折叠.氨基酸序列与其他物种氨基酸序列的同源性为22.37％～41.26％,在保守结构域CSD区同源性达到75％以上.实时定量PCR检测,Y-box基因在中间球海胆体腔液、管足、围口膜、雄性性腺、雌性性腺、肌肉和肠7个不同组织中均有表达,但差异不显著.温度胁迫下,中间球海胆Y-box基因的表达均表现为下调,并且随着温度的升高,Y-box基因的表达量呈现逐渐下降的趋势.     

饵料中添加海洋红酵母(Rhodotorula sp.) C11对幼参消化酶及免疫反应的影响

将海洋红酵母(Rhodotorula sp.) C11以104、105和106 CFU/g饵料添加到基础饵料中,每一剂量组设3个平行,每一平行50头幼参,用100 L塑料桶进行30 d静水充气养殖试验。试验期间每日投饵1次,投喂量为幼参体重的5%。投喂试验结束后,评估其对幼参消化酶及免疫反应的影响。结果显示,与对照组比较,投喂海洋红酵母C11 104、105 CFU/g,显著提高了幼参肠道胰蛋白酶活力(P<0.05);投喂海洋红酵母C11 104 CFU/g,显著增加淀粉酶活力(P<0.05)。投喂海洋红酵母C11 105 CFU/g,幼参体腔细胞的吞噬活力显著高于对照组(P<0.05)。与投喂基础饵料的幼参比较,投喂海洋红酵母C11 105、106 CFU/g,幼参具有较高的体腔液溶菌酶(LSZ)活力(P<0.05)。投喂海洋红酵母C11 104 CFU/g,幼参具有较高的体腔细胞裂解液(CLS)LSZ活力(P<0.05)。投喂海洋红酵母C11 104 CFU/g,幼参体腔液总一氧化氮合酶(T-NOS)活力显著增加(P<0.05),投喂海洋红酵母C11 104、105、106 CFU/g,幼参CLS的T-NOS活力显著提高(P<0.05)。本研究表明,饵料补充海洋红酵母C11可促进幼参的消化酶活力和免疫反应。     

饵料中添加海洋红酵母(Rhodotorula sp.)C11对幼参消化酶及免疫反应的影响

将海洋红酵母(Rhodotorula sp.)C11以10~4、10~5和10~6CFU/g饵料添加到基础饵料中,每一剂量组设3个平行,每一平行50头幼参,用100 L望料桶进行30 d静水充气养殖试验。试验期间每日投饵1次,投喂量为幼参体重的5%。投喂试验结束后,评估其对幼参消化酶及免疫反应的影响。结果显示,与对照组比较,投喂海洋红酵母C11 10~4、10~5CFU/g,显著提高了幼参肠道胰蛋白酶活力(P0.05);投喂海洋红酵母C11 10~4CFU/g,显著增加淀粉酶活力(P0.05)。投喂海洋红酵母C11 10~5CFU/g,幼参体腔细胞的吞噬活力显著高于对照组(P0.05)。与投喂基础饵料的幼参比较,投喂海洋红酵母C11 10~5、10~6CFU/g,幼参具有较高的体腔液溶菌酶(LSZ)活力(P0.05)。投喂海洋红酵母C11 10~4CFU/g,幼参具有较高的体腔细胞裂解液(CLS)LSZ活力(P0.05)。投喂海洋红酵母C1110~4 CFU/g,幼参体腔液总-氧化氮合酶(T-NOS)活力显著增加(P0.05),投喂海洋红酵母C11 10~4、10~5、10~6CFU/g,幼参CLS的T-NOS活力显著提高(P0.05)。本研究表明,饵料补充海洋红酵母C11可促进幼参的消化酶活力和免疫反应。     

可口革囊星虫生殖周期的观察

通过对可口革囊星虫体腔生殖细胞的发育和形态特征的周年观察,逐月统计体腔卵母细胞的数量,研究其变化趋势。结果表明,可口革囊星虫雌雄异体,性比为1∶1,无可见的生殖腺结构,原生殖细胞在体腔液中发育。体腔内全年都有生殖细胞存在,排卵期与产卵期出现重叠现象,卵母细胞分批成熟,分批产卵。根据卵母细胞的形态特点和存在方式可分为5个发育阶段:细胞增殖期、细胞质生长期、胶质膜形成期、成熟前期和成熟期。雄性生殖细胞在成熟之前,以细胞团的形式存在于体腔液中,其发生和产出过程,在时间上与卵母细胞同歩。成熟的生殖细胞经肾管排出、体外完成受精。宁德地区可口革囊星虫的生殖季节为5~9月,其中7~8月为繁殖盛期。体腔卵母细胞的长径与短径呈线性关系:Y=1.14X-0.7316(R2=0.9711)。     

抗“腐皮综合症”刺参体腔液指标变化的初步研究

对用“腐皮综合症”致病菌灿烂弧菌（Vibrio splendidus）感染刺参的7个体腔液指标进行了测定。结果显示：1）抗病刺参和易感刺参体腔液吸光值和颗粒细胞浓度在第10天差异显著（P〈0．05）。2）抗病刺参和易感刺参总细胞浓度和透明细胞一淋巴样细胞浓度在第5天差异显著（P〈0．05）。3）抗病刺参体腔液碱性磷酸酶活力在试验各天均保持较高水平,且在第10天与易感刺参有显著差异（P〈0．05）;易感刺参体腔液酸性磷酸酶活力在第5天明显高于抗病刺参（P〈0．05）,之后各天迅速降低,并显著低于抗病刺参（P〈0．05）。4）抗病刺参和对照组刺参超氧化物歧化酶活力各天始终无显著蒡异（P〉0．05）．抗病刺参和易感刺参在第10天蒡异昂著（P〈0．05）．