小麦花药诱导产生单倍体植株的染色体加倍技术研究

为了提高小麦花药单倍体植株的加倍效率,以小麦冀5006/9204和核生2号/08004 F1杂交组合为试材,用不同浓度的秋水仙碱分别对小麦花药和植株分蘖节进行了处理,其中花药处理方法为在C17诱导培养基中分别加入浓度0.02‰、0.05‰和0.10‰的秋水仙碱,分蘖节处理方法为分别用浓度0.20‰、0.50‰、0.75‰和1.00‰的秋水仙碱浸泡单倍体再生植株分蘖节各5 h和10 h,研究秋水仙碱不同浓度与处理方法对染色体加倍率的影响。结果表明：在含有秋水仙碱0.02‰的诱导培养基上再生单倍体植株的染色体加倍率最高,冀5006/9204和核生2号/08004 F1代杂交组合的染色体加倍效率分别为52.38%和47.37%;0.75‰秋水仙碱溶液浸泡分蘖节5 h的染色体加倍率最高,为65.06%。尽管我们用秋水仙碱处理花药的加倍率不如处理分蘖节的效果好,但该方法可能比处理分蘖节更经济、简便,可达到快繁与加倍同时进行的目的。     

秋水仙素对非洲菊单倍体加倍效果研究

【目的】研究非洲菊单倍体的加倍方法。【方法】采用秋水仙素不同处理方式、不同处理时间和浓度对非洲菊单倍体(2n=x=25)进行加倍效果研究。【结果】和单倍体相比,双单倍体(2n=2x=50)株型较大,叶片较宽,气孔保卫细胞叶绿体数较多。培养基添加秋水仙素法加倍效果最好,全株浸泡法次之,茎尖浸泡法最差。全株或茎尖在0.02%的秋水仙素溶液中浸泡1 d,对单倍体植株无加倍效果;0.1%的秋水仙素添加至增殖培养基处理7 d对植株造成的伤害最大,死亡率达80%,但加倍率只有4%。【结论】0.05%的秋水仙素添加至增殖培养基处理4 d,非洲菊单倍体植株的加倍效果最好(42%)。     

不同除草剂对玉米单倍体成熟胚的加倍效果

分析比较了3种除草剂对玉米单倍体成熟胚的加倍效果,以期找到一种玉米单倍体加倍的新方法。以先玉335、中地88和郑单958这3个基因型诱导的单倍体籽粒为材料,分别以不同浓度(1、5、10、20μmol/L)的甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵溶液作为加倍药剂处理玉米单倍体成熟胚,统计成熟胚的加倍率。结果表明,不同浓度的3种除草剂对玉米单倍体成熟胚加倍均有效果,加倍率为7.83%～85.16%,其中,10μmol/L的甲基胺草磷的效果最好,先玉335、中地88和郑单958的单倍体成熟胚平均加倍率分别为85.16%、80.20%和66.30%。说明甲基胺草磷对提高玉米单倍体成熟胚的加倍率最有效。     

秋水仙素和除草剂浸芽加倍玉米单倍体效率的研究

以Mo17× PHB1M诱导的单倍体子粒为试验材料,利用戊炔草胺、甲基胺草磷和秋水仙素为加倍药剂,浸芽处理单倍体种子.结果表明:戊炔草胺质量浓度为4～16 mg/L时的加倍率为5％～16％;甲基胺草磷质量浓度为8～32 mg/L时的加倍率为8％ ～ 16％;秋水仙素质量浓度为0.4～1.0 mg/L时的加倍率为5.5％ ～16.5％,3种药剂对玉米单倍体加倍均有效果.其中8 mg/L的戊炔草胺、21 mg/L的甲基胺草磷、0.7 mg/L的秋水仙素浸芽8h的玉米单倍体加倍率均为各组最高.戊炔草胺和甲基胺草磷可以替代秋水仙素加倍玉米单倍体.     

小麦×玉米产生小麦单倍体的染色体加倍研究

 小麦与玉米杂交产生的单倍体植株无染色体自然加倍发生 ,为获得加倍单倍体 ,进行了两种秋水仙素加倍处理。结果表明 ,在培养基中直接加入秋水仙素处理已培养 7d的幼胚 ,无秋水仙素对照的幼胚萌发率为 6 7.4 % ,存活的植株均未结实 ;而经过浓度为 5 0mg/L、10 0mg/L和 2 0 0mg/L秋水仙素处理的幼胚萌发率分别是 32 .1%、2 6 .4 %和 16 .3% ,加倍率分别是 85 .7%、10 0 %和 5 0 %。秋水仙素处理时间在 2 4～ 72h范围内 ,随着处理时间的延长 ,幼胚萌发率随之降低 ,死亡率随之增加 ,以 2 4h效果较好。用浓度为 5 0 0mg/L、75 0mg/L、10 0 0mg/L的秋水仙素溶液浸根加倍处理 ,平均加倍率分别是 89.6 %、76 .0 %和 73.3% ,而用浓度为 5 0 0mg/L秋水仙素处理壮苗获得了98.2 %的加倍率和 93.2 %的加倍处理效率     

提高小麦×玉米中小麦单倍体苗加倍率的研究

以小麦玉米杂交产生的小麦单倍体为材料,研究了单倍体苗分蘖节切口预处理对加倍率的影响。结果表明,加倍前对分蘖节进行切口处理的单倍体苗加倍率和加倍效率均达90.3%,比对照高16个百分点。对560个加倍成功的DH株的第一结实穗位分布进行了统计,从主茎开始结实的植株只占31.1%,其余均从分蘖穗开始结实,个别植株到第13个分蘖穗才收到种子;前5个穗位开始结实的植株占82.1%,前7个穗位占94.3%。结果表明,小麦单倍体的加倍率不仅受加倍方法的影响,还与加倍处理前后的栽培技术有关,培育多蘖壮苗、提高分蘖成穗率是提高加倍率的重要保障。     

甲基胺草磷加倍玉米单倍体效果的初步研究

以高诱1号诱导的不同基因型玉米单倍体为材料,在3～5叶期用不同浓度的甲基胺草磷溶液进行滴心处理,研究甲基胺草磷加倍单倍体的效果。结果表明：不同浓度的甲基胺草磷溶液的加倍效率存在一定差异,100μmol／L的甲基胺草磷溶液处理的单倍体加倍效率最高;不同遗传背景材料的加倍效果存在差异。     

小麦单倍体植株的越夏及染色体加倍方法的研究

研究了小麦单倍体植株的越夏技术及染色体加倍方法。结果表明:在16±1℃低温条件下,在壮苗培养基中附加2～3mg／l的MET不仅可以使花粉植株安全越夏,并可大幅度提高移栽成活率,以3mg／l MET抑制作用最明显,但移栽成活率以2 mg／l的效果最高。在以秋水仙素注射分蘖节、浸泡分蘖节和自然加倍这三种加倍方法中,以注射分蘖节的加倍效果最好。采用该方法加倍,3个供试基因型的加倍成功率分别为64．29％、46．67％和37．79％,比自然加倍率(对照)提高了184．72％、195．57％和222．53％。     

羽衣甘蓝小孢子再生植株的倍性鉴定及加倍

为了提高羽衣甘蓝小孢子植株中二倍体比例,以波浪叶红心、皱叶红心、红欧、白欧为供试材料,利用流式细胞仪对其小孢子再生植株的倍性进行分析,采用秋水仙素溶液对单倍体植株和游离小孢子进行诱导加倍。结果表明:含75 mg/L秋水仙素的培养基处理单倍体试管苗,波浪叶红心与皱叶红心的双单倍体比例分别为20.0%、5.0%,效果较差;1 000 mg/L秋水仙素溶液浸根处理的波浪叶红心与皱叶红心的双单倍体比例分别为53.3%和25.0%,效果较好;50 mg/L秋水仙素溶液处理小孢子36 h,4份材料的加倍效果均最好,其中红欧双单倍体比例高达55.6%。     

单倍体诱导系在玉米育种研究中的初探

利用3个单倍体诱导系与8个不同基因型母本(普通玉米、甜玉米、糯玉米和甜糯玉米)杂交诱导,根据籽粒颜色、根尖染色体压片、气孔密度并结合田间植株表现鉴定单倍体,并利用秋水仙素处理加倍.结果表明,不同诱导系间诱导率存在差异,MT041 平均单倍体诱导率显著高于其他 2个诱导系,诱导率为4.17％;不同基因型母本间也存在显著差异,糯玉米和普通玉米材料单倍体率显著高于甜玉米,甜糯玉米杂交种对甜玉米单倍体提高有利.0.06％秋水仙素溶液浸根加倍效果显著高于0.02％浓度,但高浓度的秋水仙素处理成苗率不高,结果表明加倍技术仍然是制约DH育种技术广泛应用的瓶颈.     

超高压下Ca~(2+)与Na~+离子对甜菜果胶结构及流变性质的影响

[目的]研究超高压下不同浓度Ca2+与Na+对甜菜果胶结构及流变性质的影响,为甜菜果胶在食品中的应用提供理论依据。[方法]甜菜果胶用浓度0.05 mol·L-1的Tris-HCl溶液溶解,添加不同浓度Ca2+(2、12和20mmol·L-1)和Na+(0.05、0.1和0.6 mol·L-1),配制成1%(w/v)甜菜果胶溶液后进行超高压处理,然后分别对甜菜果胶分子量、微观结构、黏度和动态粘弹性进行测定。[结果]与常压下相比,在450 MPa条件下处理不同时间(10、20、30和50 min)后,甜菜果胶在1 550 cm-1处均出现新的吸收峰,甜菜果胶溶液的屈服应力σ0显著增加,但不同超高压处理时间之间无显著差异。添加不同浓度Ca2+或Na+的甜菜果胶在450 MPa条件下处理30 min,其结构及流变性的变化有所不同。相对于未添加Ca2+或Na+的甜菜果胶,添加2 mmol·L-1 Ca2+离子使甜菜果胶溶液屈服应力σ0、储能模量G’和损耗模量G"均明显增加,当Ca2+浓度增加到12 mmol·L-1和20 mmol·L-1时,果胶的流变性质变化不显著;添加2 mmol·L-1 Ca2+使甜菜果胶分子发生明显的交联。果胶分子量由只高压处理的2.25×105 Da显著增加到6.07×105 Da,Ca2+的添加浓度增加到20 mmol·L-1,果胶的分子量变为5.99×105 Da,与添加2mmol·L-1 Ca2+时没有显著差异,其流变性质变化亦不显著。相对于未添加Ca2+或Na+的甜菜果胶,添加0.05 mol·L-1 Na+也使甜菜果胶的屈服应力σ0显著增加,并且随着Na+浓度的持续增加,果胶的屈服应力σ0显著增加;而只有当Na+浓度增加到0.6 mol·L-1时,甜菜果胶储能模量G’和损耗模量G"才发生明显增加。添加0.1 mmol·L-1 Na+的甜菜果胶,其果胶分子链相互交联成网状,果胶分子发生明显聚集,果胶分子量显著增加到11.95×105 Da;而当Na+浓度增加到0.6 mol·L-1时,果胶链呈棒状结构,果胶分子量显著降低到5.53×105 Da。[结论]超高压下Ca2+与Na+可能与甜菜果胶分子结合使其结构发生改变,进而影响甜菜果胶的结构及流变性质。     

Study on Chromosome Doubling for Haploid Produced by Wheat × Maize Crossing

There is no spontaneous chromosome doubling in haploid plants produced by wheat × maize crossing. In order to obtain doubled haploid, two chromosome doubling methods were used. Results showed that: After adding colchicine solution directly into a medium for young embryos that had been cultured 7 days,frequencies of embryo germination in colchicine concentrations of 50lng/L, 100mg/L and 200mg/L were 32.1%, 26.4% and 16.3%, respectively, and frequencies of chromosome doubling were 85.3%, 100% and 50.0%, respectively. But in the control without colchicine, the frequency of embryo germination was 67.4%and no seed was setting. As the time of colchicine treatment increased from 24 to 72 hours, the frequency of embryo germination was reduced, and 24 hours had better results. After soaking seeding crowns and roots with colchicine solution of 500mg/L, 750mg/L and 1 000mg/L for 5 hours, the frequencies of doubling were 89.6%, 76.0% and 73.3%, respectively. By soaking crowns and roots of strong seedings with 500mg/L colchicine solution, the frequency and efficiency of doubling were 98.2% and 93.2%, respectively.     

捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的原核表达及重组蛋白酶活性测定

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一,该病在中国呈全国性流行。为研究捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性,对其基因进行了克隆、原核表达,并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸β氧化中的作用。【方法】根据NCBI公布的H.contortus ZJ株daf-22 cDNA序列(Gen Bank:HQ738470.1)设计特异性引物,克隆Hc-daf-22基因并构建重组质粒pET-22b-Hc-daf-22,经测序鉴定正确后将其转化E.coli BL21,经终浓度为0.1 m mol·L~(-1) IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达4h,离心菌液,50 mmol·L~(-1)浓度的PBS溶液重悬菌体溶液,冰浴超声破碎后上清沉淀分别进行SDS-PAGE分析。超声破碎后产物以镍柱亲和色谱法分离纯化重组蛋白Hc-DAF-22,并用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况及以抗His血清作为一抗Western Blot鉴定。纯化后蛋白用超滤管浓缩除去盐分,并按照蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。利用天然状态下的乙酰乙酰CoA(AcAc-CoA)分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物特性,酶活试验以乙酰乙酰辅酶a为底物建立标准曲线。硫解酶体外测活体系为(50 mmol·L~(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L~(-1) MgCl_2,60μmol·L~(-1)CoA,10μmol·L~(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白),通过记录反应过程中由于底物(AcAc-CoA)的减少而引起303 nm波长下的吸收值的变化,从而计算出硫解反应的初始反应速率,最终确定复性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性。在相同条件下,取AcAc-CoA底物浓度为10μmol·L~(-1)的反应体系(50 mmol·L~(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L~(-1)MgCl_2,60μmol·L~(-1) CoA,10μmol·L~(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白于室温起始反应),分别调节反应体系的温度及pH梯度,确定Hc-DAF-22最佳酶活反应温度及pH条件。【结果】成功克隆Hc-daf-22基因,测序结果与NCBI已公布的H.contortus ZJ株Hc-daf-22基因序列比对基因相似度为99.9%,并实现重组子pET-22b-Hc-daf-22在E.coli BL21体内进行表达,表达产物经SDS-PAGE和Western Blot检测显示,pET-22b-Hc-daf-22基因在大肠杆菌中成功表达,呈部分可溶性,融合蛋白的分子量约为59 k D,测得蛋白浓度为1.70μg·μL~(-1);针对该表达产物的酶活分析结果表明,原核表达的Hc-DAF-22具有一定的硫解酶活性,其最适反应pH为8.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为33.765μmol·L~(-1)和1 784 nmol·L~(-1)·min~(-1)。【结论】捻转血矛线虫DAF-22是过氧化物酶体脂肪酸β氧化的关键酶之一,本试验通过体外酶活试验成功测定Hc-DAF-22蛋白的酶活性,证明Hc-DAF-22具有一定硫解酶活性,但与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)同源蛋白相比硫解酶活性较低。     

盐分不均匀分布对紫花苜蓿生长和离子特征的影响

【目的】土壤盐分浓度在空间上呈不均匀分布,研究不均匀盐胁迫对紫花苜蓿生长、水分吸收、光合作用以及根叶部位K~+和Na~+的影响,探讨紫花苜蓿适应根部不均匀盐胁迫的生理机制,为紫花苜蓿耐盐品种培育及改良盐碱地紫花苜蓿种植技术提供理论依据。【方法】通过水培法,将紫花苜蓿幼苗的根均匀分成两部分置于分根装置中,给予两侧根部相同或不同浓度的NaCl处理,设置对照(0/0)、低盐胁迫根部分别为0 mmol·L~(-1)NaCl(0/400)和100 mmol·L~(-1)NaCl(100/300)的不均匀盐胁迫处理和均匀的200 mmol·L~(-1)NaCl胁迫处理(200/200),处理7 d后取样分析。【结果】不均匀盐胁迫与均匀盐胁迫均抑制了紫花苜蓿生长,导致水分吸收减少、叶片Na~+浓度增加和叶片K~+浓度减少。然而,0/400处理紫花苜蓿地上部分鲜重、水分吸收分别比200/200处理提高了24.3%和44.2%,其叶片Na~+浓度比200/200处理降低了53.6%、叶片K~+浓度与200/200处理无显著差异。0/400处理0侧根部水分吸收比对照提高12.3%、Na~+浓度是对照的10.5倍、K~+浓度与对照无显著差异。100/300处理紫花苜蓿地上部分鲜重、整株水分吸收、叶片K~+浓度均与200/200处理无显著差异。100/300处理叶片Na~+浓度比200/200处理提高了31.0%。100/300处理100侧根部水分吸收比对照降低了33.9%、Na~+浓度是对照的39.5倍、K~+浓度比对照降低了31.3%。0/400、100/300与200/200的蒸腾速率、气孔导度和胞间二氧化碳浓度无显著差异且均显著低于对照,而0/400的净光合速率与200/200无显著差异,均显著高于对照,100/300的净光合速率与对照无显著差异。【结论】紫花苜蓿根部平均盐分浓度为200 mmol·L~(-1)NaCl时,一侧根部NaCl浓度等于或高于其半致死浓度,另一侧根部NaCl浓度为0 mmol·L~(-1)时,不均匀盐胁迫缓解了根部高浓度盐胁迫对紫花苜蓿生长的抑制,当低盐胁迫根部NaCl浓度为100 mmol·L~(-1)时,不均匀盐胁迫不能够缓解根部高浓度盐胁迫对紫花苜蓿生长的抑制。     

化学杀雄剂SQ-1和阿拉伯葡聚糖蛋白对小麦品种间杂交及远缘杂交成胚率的影响

【目的】探究化学杀雄剂SQ-1对小麦品种间、小麦与近缘植物间、小麦与远缘植物间杂交成胚率的影响,以及阿拉伯葡聚糖蛋白对小麦与玉米杂交成胚率和得苗率的影响。研究结果对于合理选用小麦杂交方式,提高小麦杂交结实率和利用玉米诱导小麦单倍体植株的效率具有重要意义。【方法】通过在小麦拔节期喷施化学杀雄剂SQ-1,开花期分别授以小麦花粉和远缘植物(黑麦、玉米)花粉,并在小麦授玉米花粉后的处理液中加入不同浓度的阿拉伯葡聚糖蛋白(arabinogalactan proteins,AGP),对小麦与玉米杂交后产生的幼胚进行离体拯救培养,统计授粉小花数、接种幼胚数、膨大颖果数、结实粒数、萌发单倍体幼胚数和单倍体植株数,计算结实率、颖果膨大率、成胚率、萌发率和成苗率并对所得数据进行差异显著性分析,结合细胞学观察结果,研究SQ-1对小麦品种间杂交及远缘杂交结实性的影响,以及AGP对小麦单倍体胚诱导率的影响。【结果】在不同小麦品种间杂交中SQ-1处理结实率19.8%—83.3%,人工去雄的结实率为69.4%—93.0%,SQ-1对不同品种的影响不同,Fielder对SQ-1的反应比较敏感;在中国春与兰州黑麦杂交中,SQ-1处理的结实率为65.5%,人工去雄处理的结实率为78.8%,两种处理方式产生的F1杂种的染色体数均为28条;在不同小麦品种与玉米品种郑单58杂交中,SQ-1处理小麦单倍体胚的成胚率为1.11%—1.41%,人工去雄小麦单倍体胚的成胚率为2.38%—14.29%;在小麦与玉米杂交后的处理液中添加0.5—2.0 g·L-1 AGP一定程度地提高了小麦单倍体胚获得率和成苗率。另外,在玉米花粉诱导的单倍体胚离体培养过程中,发现13.07%的胚发育出了2—6株苗;显微镜观察发现,玉米花粉诱导后18 d左右小麦单倍体胚上出现了多个突起,这些突起在离体培养条件下进一步发育为形态健全的小植株,其染色体数目均为21条。【结论】化学杀雄剂SQ-1减低了小麦品种间杂交及小麦与黑麦、玉米间杂交的成胚率,AGP提高了小麦与玉米间杂交单倍体成胚率和成苗率。     

褪黑素对大鼠胰岛瘤细胞INS-1胰岛素和Gαi/o蛋白基因表达的影响

【目的】研究褪黑素对大鼠胰岛瘤细胞INS-1中胰岛素和Gαi/o蛋白基因表达的影响,探究褪黑素在m RNA水平对Gαi/o和Insulin1调节作用中可能存在的分子机制。褪黑素(melatonin,MT)是松果腺分泌的一种吲哚类神经内分泌激素,在机体内可调节胰岛素的分泌而使其呈现昼夜节律性分泌,影响葡萄糖昼夜代谢水平的变化进而维持机体血糖的相对恒定,故对于褪黑素影响胰岛素表达的研究可能会对褪黑素在胰岛素昼夜节律性分泌中的调控作用提供依据。【方法】将冻存的INS-1细胞复苏培养至第三代,INS-1细胞传代后,用RPMI1640培养基培养INS-1细胞约24—48 h,当细胞密度达60%—70%时,使用无血清无葡萄糖的RPMI1640洗2次,然后在INS-1细胞培养外液中分别加入不同浓度(0、10、20、30、50 mmol·L-1)的葡萄糖及100 nmol·L-1褪黑素和不同浓度葡萄糖孵育INS-1细胞12 h,观察和统计INS-1细胞的形态学变化。利用Easy Pure?RNA Kit提取INS-1细胞的总RNA,核酸蛋白测定仪测定细胞总RNA的浓度和纯度,其次利用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测细胞的总RNA质量,Trans Script One-Step g DNA Removal and c DNA Synthesis Super Mix反转录合成c DNA。利用Primer Premier5.0引物设计软件,参考Gen Bank上已登录的基因序列进行Insulin1、Gαi1、Gαi2、Gαo、PKA和PKCα引物的设计。应用q RT-PCR法进行检测处理后的INS-1细胞Insulin1、Gαi1、Gαi2、Gαo、PKA和PKCαm RNA水平的变化。【结果】用含不同浓度葡萄糖培养液孵育INS-1细胞后,观察发现随着培养基中葡萄糖浓度含量的增加INS-1细胞突触的增长呈现先增加后减少的趋势,其中20 mmol·L-1葡萄糖处理组INS-1细胞突触的增长明显,而20 mmol·L-1葡萄糖和100 nmol·L-1褪黑素处理组INS-1细胞表面积增大,但突触增长却不明显;培养基中含不同浓度葡萄糖的处理组中,Insulin1 m RNA水平呈现先升后降的趋势,Gαi1 m RNA水平则呈现先降后升的趋势,其中20 mmol·L-1葡萄糖处理组,Insulin1 m RNA水平显著增加(P0.05),Gαi1 m RNA水平显著减少(P0.05),而Gαi2和Gαo则无显著变化(P0.05),因而Gαi1表现出与Insulin1 m RNA水平呈现负相关性而非Gαi2、Gαo与Insulin1 m RNA水平呈现负相关性;20 mmol·L-1葡萄糖和褪黑素处理组和20 mmol·L-1葡萄糖处理组相比,20 mmol·L-1葡萄糖和褪黑素处理组的Gαi1 m RNA水平显著增高(P0.05),且Insulin1和PKCαm RNA水平显著减少(P0.05),PKA m RNA水平则减少不显著(P0.05)。【结论】褪黑素能够抑制INS-1细胞Insulin1的表达,减少胰岛素的分泌导致INS-1细胞适应性增生。褪黑素与其受体结合后可促进Gαi1 m RNA水平增高而抑制PKCα的表达,使得Insulin1的表达受到抑制,胰岛素分泌减少,使血糖在夜间得以维持相对恒定。     

异源表达irrE转基因烟草的耐盐耐旱性

【目的】IrrE是从耐辐射异常球菌中发现的全局调控蛋白,主要通过修复强辐射等逆境条件下DNA损伤,提高耐辐射异常球菌对极端逆境环境的抗性。研究按植物密码子优化的irrE后导入烟草对转基因烟草耐逆能力的提高,为棉花等作物耐逆育种研究打下基础。【方法】按照植物密码子优化细菌irrE并合成基因;通过酶切连接法构建irrE植物表达载体;通过叶盘法转化烟草并PCR验证获得阳性转基因再生苗;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析转基因株系中irrE的表达量;通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测IrrE编码蛋白;通过NaCl和甘露醇模拟盐处理和干旱处理分析纯和转基因株系的耐盐耐旱性,通过测定抗逆相关生理指标鉴定其对植物耐逆的贡献。【结果】按照植物密码子对irrE进行改造,共优化了241个密码子;构建了高效植物表达载体GBI-IE;利用除草剂草甘膦作为筛选剂获得转基因再生幼苗,并通过PCR验证共获得15个独立的转基因株系;通过q RT-PCR分析从中选取两个表达量最高的株系GO1和GO2进行后续的抗逆性分析;Western blot验证IrrE编码蛋白在GO1和GO2中能正确翻译。转基因烟草耐盐耐旱性分析:种子萌发试验表明,正常1/2 MS培养基上,转基因株系GO1和GO2发芽率和非转基因野生型对照之间没有明显的差异。然而250 mmol·L~(-1)NaCl培养基上GO1和GO2萌发率分别为78.8%和90.0%,野生型仅为10.3%,分别提高了68.5%和79.7%。类似地,300 mmol·L~(-1)甘露醇条件下,野生型的萌发率为39.7%,转基因株系GO1和GO2分别提高了42.9%和50.8%;正常萌发的种子移栽到250 mmol·L~(-1) NaCl和300 mmol·L~(-1)甘露醇条件12 d后,转基因株系根长、侧根数以及鲜重等生理指标显著高于野生型对照;温室中正常生长30 d的苗期烟草在250 mmol·L~(-1) NaCl处理下,转基因烟草SOD、CAT活性比野生型对照分别提高了48.80%和88.55%,而MDA含量比野生型对照降低了61.61%,胁迫响应基因Nt ABF2、Nt LEA5、Ntzfp、Nt CDPK2在GO1和GO2转基因株系中表达量均显著高于非转基因野生型。和盐处理结果类似,300 mmol·L~(-1)甘露醇的处理下,转基因烟草的耐旱生理生化指标均优于非转基因对照。【结论】烟草中异源表达耐辐射异常球菌irrE可以显著提高耐盐耐旱性;其多效性耐非生物胁迫能力的提高表明其可作为植物耐逆基因工程的优良基因源。     

不同铵硝配比条件下BPDS-Fe(Ⅱ)对玉米幼苗耐低铁胁迫差异的影响

【目的】作物生产中缺铁问题十分普遍,筛选耐低铁品种具有重要意义。文中采用BPDS(4,7-diphenyll,10-phenanthroline disulfonic acid)专性螯合Fe(Ⅱ),探究BPDS-Fe(Ⅱ)对2种玉米自交系表型特征与生理特性的影响,旨在解析2个自交系耐低铁胁迫差异及其可能机制,为筛选耐低铁品种提供理论依据。【方法】选用2个玉米自交系Wu312与Ye478,以铵硝比1﹕1与1﹕7为供氮条件,分别设置14与10个不同的BPDS-Fe(Ⅱ)浓度,观察植株表型特征,测定叶片SPAD值、地上部与根系干物重、根冠比,测定地上部铁、锰、铜、锌浓度以及新叶活性铁浓度。利用SPAD-502 plus叶绿素仪测定新叶SPAD值;将烘干样品剪碎后,用HNO3-H2O2溶液消煮,经密闭微波消煮后,用ICP-AES测定消煮液中的微量元素;取新叶尖端剪碎,称2.00 g鲜样,按照1﹕10比例加入1 mol·L~(-1)盐酸,震荡5 h后过滤,用ICP-AES进行测定。【结果】在铵硝比1﹕1的供氮条件下,根系产生根系分泌物,根际pH在24 h内从6.0显著下降至约4.0;与对照处理(不供铁)相比,当BPDS-Fe(Ⅱ)浓度为40μmol·L~(-1)时,Wu312的地上部干物重显著下降了31%,Ye478则显著下降了64%;Wu312根系干物重无显著变化,但Ye478显著下降了63%;二者的根冠比均已超出正常范围(正常值:0.20—0.28),地上部与根系生长受到抑制。调整铵硝比为1﹕7后,当BPDS-Fe(Ⅱ)浓度为40μmol·L~(-1)时,Wu312地上部干物重是对照幼苗的8倍,Ye478则接近10倍,植株生长恢复正常;Ye478的叶片SPAD值、地上部与根系干物重、新叶活性铁浓度均显著高于Wu312,表现出生长与保绿性方面的显著优势;当BPDS-Fe(Ⅱ)浓度为0.1μmol·L~(-1)时,Wu312被竞争致死,无法发育出第五片叶,Ye478仍能维持生长,发育至第五片叶,叶片返绿明显;地上部铁浓度在不同自交系间无显著差异;植株地上部铁含量与锰、铜、锌浓度呈显著负相关。【结论】降低NH_4~+-N的供应比例有利于改善根际pH,减少根系分泌物;Ye478为耐低铁品系,Wu312为铁敏感品系;Ye478与Wu312在0.1μmol·L~(-1)浓度条件下表型出现最显著差异;地上部与根系生物量、叶片SPAD值是表征玉米幼苗耐低铁胁迫差异的最佳指标,根冠比以及新叶活性铁浓度是良好指标;玉米幼苗耐低铁胁迫的可能机制包括根系分泌质子,地上部将光合作用产物优先分配给根系,以及铁在植物体内的转运与再分配。     

甘蓝型油菜基因型对离体小孢子染色体加倍的反应

采用秋水仙碱处理甘蓝型油菜不同基因型的离体小孢子,研究了小孢子再生植株的染色体加倍特性 及其与基因型的关系。将发育到单核晚期一双核早期的小孢子分别接种于含10、20、50、100 mg／L秋水仙碱的 NLN液体培养基中处理24 h或48 h进行染色体加倍,然后将处理过的小孢子转接于不含秋水仙碱的相同培 养基中诱导胚状体。21种基因型小孢子再生植株中双单倍体比率为23．94％～99．42％。方差分析的结果表 明,基因型相似的品系和杂种之间染色体加倍率差异不显著,基因型不同的一些品系和杂种间差异显著。由 此说明,基因型对秋水仙碱处理离体小孢子诱导染色体加倍的反应不同。