玉米PEPC基因和PPDK基因在籼稻明恢63中的整合及与光合作用相关的特性分析

丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）是C4植物光合作用途径中,二氧化碳固定的关键酶。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是在C4和景天酸（CAM）植物光合作用的初级碳同化中的一个关键酶,该酶介导不可逆的β羧化反应,将磷酸烯醇式丙酮酸转化成草酰乙酸和磷酸。本研究将编码玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的质粒和编码玉米丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）基因的质粒通过基因枪轰击转化的方法同时导入籼稻明恢63中,PCR-Southern印迹杂交的结果表明,玉米丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）基因已经整合到明恢63中。在温室条件下,分析了转基因明恢63植株的剑叶全氮含量,结果表明,不同的转基因明恢63植株,其剑叶的全氮含量是不同的,大部分转基因明恢63植株剑叶的全氮含量高于非转基因明恢63对照的全氮含量,转基因明恢63植株ZHM3-50剑叶全氮含量为3．82％,比非转基因明恢63对照高0．45％。对转基因明恢63植株的产量构成因素的分析结果表明,在温室条件下,不同的转基因明恢63植株之间,产量构成因素差异比较大,比如植株干重、收获指数等。这些有助于育种家们选择不同的育种材料。     

转玉米PEPC和PPDK基因对‘南林895杨’叶绿素参数影响的比较

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和磷酸丙酮酸二激酶(PPDK)是C_4植物维持高效光合作用的关键酶,本研究通过农杆菌转化手段将玉米PEPC基因和PPDK基因成功导入‘南林895杨’,并进行叶绿素含量和荧光参数检测,结果显示:高光强胁迫下,所有转基因植株的叶绿素含量的下降幅度(34.2%～38.1%)均小于对照组(41.2%);转基因株系原初光化学效率下降幅度(29.0%～47.3%)和实际光化学效率下降幅度(29.5%～45.9%)均分别小于对照组(54.9%, 51.2%),二者具有一致性;高光照条件下,转基因株系光化学淬灭系数qP值(0.45～0.49)全面高于对照组(0.43);非光化学淬灭系数qN值显示转基因株系在高光照条件下与对照组相比没有明显的耐光氧化能力的提高。研究结果表明,转玉米PEPC和PPDK基因‘南林895杨’对于强光的利用能力增强,从而提高了转基因植株的光合性能。     

家稗丙酮酸磷酸双激酶序列分析及三维结构建模

【研究目的】目前已从许多种植物中克隆了其PPDK基因,但是对于其蛋白结构的分析尚未报道,此文通过生物信息学方法对家稗PPDK的序列进行了分析,并对其三维结构进行了建模分析;【研究方法】利用DNASTAR、Vector NTI 9、SignalP等生物信息学平台对[Echinochloa crusgalli var frumentacea(Roxb.)W.F.Wight]丙酮酸磷酸双激酶（Pyruvate orthophosphate dikinase）进行了序列分析和三维结构建模;【研究结果】家稗丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）同来自于高等植物的PPDK具有较高的同源性,无信号肽,存在17个跨膜结构区,二级结构是由许多螺旋、转角和少量折叠构成。同时在一二级结构分析的基础上,利用同源建模的方法完成了三维结构的建模。【结论】家稗PPDK蛋白同来自高等植物中的更为相近,无信号肽,有17个跨膜结构区,其三维结构为一同源四聚体。     

家稗丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因的克隆及序列分析

为揭示C4植物家稗[Echinochloa crusgalli var frumentacea(Roxb.)W.F.Wight] PPDK结构和功能特点,探索改善作物高光效途径,采用RT-PCR技术,克隆了家稗[Echinochloa crusgalli var frumentacea (Roxb.) W. F. Wight]丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）基因的cDNA全长。核苷酸序列分析表明, 该片段全长3 085 bp, 包含一个2 844 bp的ORF,编码948个氨基酸(GenBank登录号：AY 792619)。编码区核苷酸序列与高粱（Sorghum bicolor）、甘蔗（Saccharum officinarum）、玉米（Zea mays）等C₄型pdk基因同源率分别为85.1%、84.0%和82.0%;与水稻[Oryza sativa (japonica cultivar-group)] pdk基因同源性也高达82.6%。氨基酸序列进化树分析表明其与玉米、水稻等禾本科植物最为接近;半定量RT-PCR研究表明,pdk基因仅在绿色叶片中表达。     

家稗Pdk基因叶片特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

【研究目的】构建含家稗Pdk基因的叶片特异性表达载体;【方法】通过PstI和SalI单酶切分别从质粒pRGN及pUCm-Pdk上获得Rubisco小亚基启动子和Pdk基因,将其连入表达载体pCAMBI1301, 并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105;【结果】构建了由Rubisco小亚基启动子调控的Pdk基因植物表达载体p1301-Prbs-Pdk,选择标记基因为Hpt（潮霉素磷酸转移酶基因）,经酶切和PCR鉴定,表达载体已成功导入农杆菌EHA105中;【结论】丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）是C4光合途径中的关键光合酶,本实验中构建了含有rbcs启动子的适于单子叶植物转化的Pdk基因表达载体,为提高转基因植物光合效率奠定了基础。     

大肠杆菌gutD基因转入玉米及耐盐转基因植株的获得

中国农业大学刘岩等利用基因枪轰击法将大肠杆菌糖醇代谢关键基因——62磷酸山梨醇脱氢酶（gutD）基因转入玉米。South—ern和Western吸印杂交的结果证明了外源基因的整合和表达。用气相色谱法在转基因玉米中检测到山梨醇的合成和积累。营养液盆栽试验的初步结果表明，在盐胁迫下（200mmol／L NaC1），转基因玉米植株的耐盐性明显高于对照。     

转AtHDG11基因玉米的获得及抗旱性鉴定

培育抗除草剂和抗旱的转基因玉米种质,通过超声波辅助农杆菌介导花粉非组培法将拟南芥抗旱基因At HDG11导入玉米自交系昌7-2中,获得转基因植株。通过逐代除草剂筛选、分子检测对获得的转基因植株进行检测,获得5株转基因株系。在此基础上,以非转基因自交系昌7-2为对照,对5个转基因株系进行抗旱性鉴测;对苗期和十叶期玉米植株进行干旱胁迫处理,测定转基因植株生理活性物质和光合参数。结果表明,在干旱胁迫条件下,转基因玉米叶片的Pro含量高于非转基因玉米,MDA含量低于非转基因玉米;不论在正常生长条件下还是干旱条件下,转基因株系的光合速率和水分利用率都明显高于对照植株;而转基因株系的蒸腾速率和气孔导度则明显低于对照植株。综合室内与田间的抗旱检测结果表明,超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法在玉米上是可行的。将拟南芥HDG11基因导入玉米,同样可以有效地提高玉米的抗旱性,为玉米的抗旱育种提供新的种质资源和新的转基因方法。     

转水稻OsSIK1基因玉米植株的获得及抗旱性分析

类受体激酶基因Os SIK1具有通过激活抗氧化系统,增强水稻对于干旱和盐胁迫抗性的作用。为了丰富可利用的作物抗旱基因,获得具有较高抗旱水平的玉米新种质,通过超声波辅助花粉介导法,将水稻类受体激酶基因Os SIK1导入玉米自交系郑58中,并对转化株进行卡那霉素筛选及T1、T2、T3的PCR及Southern Blotting杂交等分子检测,获得转化植株并在T3获得转基因纯合株系。对T3转基因玉米和非转基因玉米对照以16.1%的PEG模拟水分胁迫进行抗旱性分析。结果表明,与对照相比,在水分胁迫处理下,转基因玉米株系叶片相对含水量提高了7.4%~19.8%,叶绿素含量提高了11.3%~106.9%,SOD活性上升45.8%~93.4%,而转基因玉米叶片的相对电导率下降了35.4%~58.1%,MDA含量下降了25.7%~50.4%,说明转Os SIK1基因玉米植株抗旱性得到提高,其中,5个转化株系与对照在抗旱性方面有显著差异,且生长状况明显优于对照。综上所述,研究最终获得5个转Os SIK1基因玉米株系,并证明导入水稻Os SIK1基因可以提高玉米植株的抗旱性。     

三个拟南芥抗盐基因在玉米基因组中整合、表达及抗盐性能的研究

【研究目的】以玉米优良自交系综31和178的幼胚为受体,利用农杆菌介导法将拟南芥3个耐盐基因（SOS1（SALT OVERLY SENSITWE1）、SOS2（SALT OVERLY SENSITIVE2）和SOS3（SALTOVERLY SENSITIVE3）一起转入玉米基因组中。【方法】利用愈伤的耐盐性比较和PCR检测研究耐盐基因在玉米基因组中的整合情况,并对转基因植株进行了表型分析。【结果】早期转化的抗性愈伤耐盐性比较表明．抗性愈伤比非转基因对照愈伤耐盐性明显增强,后期表型观察分析,转基因植株比对照根系发达。根冠比增大。PCR检测结果表明。同时含有三个目的基因的阳性植株占4．63％,含有两个目的基因的阳性植株占5．56％,至少含有一个目的基因的阳性植株占11．11％。【结论】表明将多个目的基因可以同时转入玉米中已成为可能。为快速培育出优质、多抗的玉米品种奠定了基础。     

抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR基因表达载体构建及在玉米中的遗传转化

玉米病毒性病害和杂草严重影响其产量和品质。以pCAMBIA5300为基础载体,应用In-Fusion克隆技术构建了双价植物表达载体pCAMBIA5300-Ubi-PKR-CaMV35S-EPSPS,其中含有抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR基因和磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS基因,分别由玉米泛素Ubi启动子和花椰菜花叶病毒35 S启动子启动。以玉米种子黄化苗的茎尖分生组织为受体,用农杆菌介导法进行遗传转化,将抗双链RNA依赖性蛋白激酶基因PKR和抗除草剂草甘膦基因EPSPS导入玉米自交系掖478中,获得转基因植株及其子代。     

转C4光合基因水稻及其在育种中的应用

按光合作用途径可将植物分为C3植物、C4植物和CAM植物,由于C4植物在高光强、高温和高氧分压的条件下,比C3植物具有较高的光合效率,作物生理和育种学家就试图用C4光合途径改造C3作物,以提高主要农作物如稻、麦和大豆等光合生产力,但通过常规杂交的方法难以奏效。近年来,随着分子生物学的兴起和植物转基因技术的快速发展,许多与C4光合作用途径相关的关键酶PEPC、NADP-苹果酸(NADP—ME)和PPDK等一系列基因已从玉米、高粱和苋菜等C4植物中被克隆,对这些基因启动子序列分离、重组、转化及表达的研究,发现它们可以在C3植物中驱动外源基因并进行组织特异性表达,而且一系列C4型光合基因导入C3植物的成功报道。特别是获得高表达的转C4光合基因水稻,表现光合能力和种子产量显著提高,而且在光逆境的条件下,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的活性提高,从而有效地清除活性氧分子,表现耐光抑制(氧化)等。目前利用转C4光合基因水稻的育种研究也取得了重要进展,培育出携带C4光合基因的高光效水稻株系,在遗传上证明了常规育种和生物技术结合可以将转C4光合基因水稻中高表达的C4光合基因遗传给后代,获得高光效的超级稻,最后提出了本研究中尚需深入研究的问题。     

转玉米C4光合酶基因水稻株系中的光合C4微循环

用转PEPC、PPDK、NADP-ME、PEPC PPDK等酶基因的水稻株系及原种野生型(WT)为材料, 研究了不同基因型水稻叶片中的C4光合微循环及其功能.用外源OAA或MA饲喂叶切片或离体叶绿体后,光合放氧速率在野生型水稻中增加了50%,在NADP-ME-和PPDK-转基因水稻中增加了50%～54%,在PEPC-和 PEPC PPDK-转基因水稻中增加了100%～150%.证明原种水稻Kitaake叶片中具有一个原初的和有限的C4光合微循环,除PPDK基因、NADP-ME基因外,外源PEPC基因或PEPC PPDK双基因导入原种水稻Kitaake后,可大幅度提高C4光合微循环的运行.水稻中C4光合微循环的增强有降低光呼吸速率(Pr)、增加净光合速率(Pn)的作用,在光能利用上,可增加PSⅡ光化学效率(Fv/Fm)、光化学猝灭(qp)、降低非光化学猝灭(qN)的作用;这些结果为转C4光合酶基因水稻中建立C4微循环系统来提高光合作用效率的可能性提供了依据.     

Causes of Sterility in Seed Set of Rice under Salinity Stress

The effects of salinity at 50 mM NaCl on floral characteristics, yield components, and biochemical and physiological attributes of the sensitive rice variety IR‐28 were studied under controlled conditions to determine the causes of sterility in seed set under salinity stress. The results showed significant decreases in panicle weight, panicle length, primary branches/panicle, filled seeds/panicle, unfilled seeds/panicle, filled seeds/plant, unfilled seeds/plant, total seeds/panicle, total seed weight/panicle, 1000‐seed weight and total seed weight/plant. The sodium content in different leaves and floral parts increased significantly. In contrast, the potassium content was decreased significantly in leaves and floral parts. A reduction in chlorophyll a and b was also noted in different parts of the leaves. Inhibition of transpiration and photosynthesis was observed in flag leaves at the grain‐filling stage. Soluble carbohydrates in different leaves were reduced significantly in salinized plants but their content in different floral parts was increased, with the exception of primary and secondary branch spikelets. Under salinity stress, total protein concentration in flag, second and third leaves were higher than in control plants. The viability of rice pollen was reduced significantly in salinized plants. It was further observed that starch synthetase activity (α1–4‐glucan glucosyle transferases) in developing rice grains was inhibited very significantly under salinity stress. From these results, it is inferred that sterility and significant reductions in seed set in rice were not merely due to reduction or inhibition of different biochemical constituents and physiological functions, but were mainly due to limitation of soluble carbohydrate translocation in primary and secondary spikelets, accumulation of more sodium and less potassium in all the floral parts, and highly significant inhibition of specific activity of starch synthetase in developing rice grains, thus resulting in failure of seed set.     

施氮量对双季稻产量及其群体光合特性的影响

以早稻株两优4024、金优402和晚稻H优159、金优207为试材分析了不同施氮水平对双季稻(早稻、晚稻)产量及群体特性的影响。施氮水平设置为120,150,180,225 kg/hm2(分别记作N1、N2、N3、N4),考察各处理的产量及其形成和分蘖动态、剑叶SPAD值、剑叶光合速率以及干物质积累等变化指标。结果表明:早稻株两优4024、金优402和晚稻H优159、金优207各处理产量均呈N1、N4、N2、N3依次增加的变化趋势;4个供试组合在分蘖盛期的总生物量呈N1、N2、N3、N4依次增大的变化趋势,在齐穗后13 d、成熟期4个组合的总生物量均呈N1、N4、N2、N3依次增大的变化趋势;相关分析发现,齐穗后13 d、成熟期的叶干质量、茎鞘干质量、穗干质量、根系干质量、地上部干质量、生物总量和剑叶光合速率与产量之间均呈显著或极显著正相关。试验结果说明,在120~180 kg/hm2,增加施氮量有利于双季稻取得高产;增加施氮量可促进分蘖盛期干物质的积累,但过量施氮会影响生长后期干物质的积累;齐穗后较大的生物总量和较高的剑叶光合速率有利于双季稻取得高产。     

Agronomic performance of an IR64 introgression line with large leaves derived from New Plant Type rice in aerobic culture

Aerobic culture is a promising water-saving technology in irrigated rice ecosystems, but the vulnerability of plants to fluctuations in soil moisture constrains leaf expansion and yield. The objective of this study was to examine whether an aboveground architecture with large leaves and reduced tillering is associated with vigorous leaf growth in aerobic rice culture. In a series of field experiments, we evaluated the agronomic performance of an IR64 introgression line, YTH323 (IR84640-11-27-1-9-3-2-4-2-2-2-B), with fewer tillers and larger leaves than IR64, derived from New Plant Type rice, under various water and nitrogen conditions. In flooded culture, YTH323 yielded the same as IR64 and 38% more than IR65564-44-51 (a New Plant Type rice) (9.0 vs. 6.6 t ha⁻¹). In aerobic culture, in contrast, it yielded 81% more than IR64 in slightly dry soils (5.1 vs. 2.8 t ha⁻¹). YTH323 had a higher leaf area index than IR64 and IR65564-44-51 under slightly dry soil conditions and under a range of nitrogen conditions. The higher and more stable yield of YTH323 in aerobic culture was attributable to greater early vigor, high specific leaf area, a high ratio of leaf weight to total biomass, and larger leaves, along with the characteristics of high-yield cultivars such as high responsiveness to fertilizers and good grain filling. We conclude that genetic modification of the aboveground architecture of IR64, a typical tropical lowland rice cultivar, to reduce tiller and leaf number improves adaptation to aerobic culture.     

春季冷害导致的小麦旗叶卷曲现象调研初报

为了系统了解春季冷害导致的小麦旗叶卷曲问题发生情况、影响因素及其对产量影响,笔者于2014年春季冷害发生的背景下在河北省曲周县10个乡镇的120个农民田块对小麦旗叶卷曲情况进行了调查,并利用田间定位实验研究了小麦旗叶卷曲发生与氮磷钾养分供应的关系。结果表明：冷害导致曲周县94.2%的农户麦田发生不同程度的旗叶卷曲现象,平均有11.2%的小麦植株发生旗叶卷曲现象。旗叶卷曲的小麦比旗叶未卷曲的小麦显著降低穗粒数,单穗重平均降低10.6%。小麦旗叶卷曲发生程度随着磷肥用量的增大及植株体内磷含量的增加而显著降低;氮、钾肥料用量及植株氮、钾含量与旗叶卷曲发生程度无明显相关。因此,生产中可通过适当增施磷肥减少因冷害导致的旗叶卷曲状况。     

转录因子OsHOX4过量表达及T1代转基因植株中纯合系鉴定

OsHOX4基因是属于水稻植物同源结构域(HD-Zip)转录因子家族的一个成员。本研究利用农杆菌介导法将OsHOX4基因转入籼稻(Oryza sativa ssp.indica)IR64中,获得54株过量表达植株。我们利用southern杂交分析确定了各个株系的拷贝数后,利用TAIL-PCR方法对4个不同的单拷贝株系进行了研究,并在其中找出T-DNA在3个单拷贝株系染色体上的插入位点(分别为染色体5,8,10)。根据T-DNA在各个株系的插入位点分别设计特异性引物,从T1代转基因株系里鉴定出纯合的植株。我们观察到OsHOX4过量表达植株的分蘖数明显高于野生型,株高比野生型明显的变矮,在同一个株系的纯合和杂合的转基因植株表型也有很大的差异。在TAIL-PCR分析基础上,为从T1代转基因作物中鉴定出纯合的植株提供了方法和理论依据。     

水稻蛋白二硫键异构酶基因沉默载体构建及其转基因后代的高温结实特性分析

采用RT-PCR法亚克隆了PDI基因保守区内450 bp的靶标序列作为干扰区段, 构建了含有内含子hpRNA (ihpRNA)的双元表达载体pTCK303-RiOsPDI, 经农杆菌介导转化日本晴, 获得转基因植株; 通过在T₀代对其潮霉素(Hyg)抗性基因的PCR鉴定, 确定携带有干扰片段的T-DNA区已整合到水稻基因组中, 且在转基因T₁代符合3∶1的分离模式。半定量PCR和荧光定量PCR的检测结果表明, PDI基因沉默转基因阳性植株不同器官中的PDI表达量均显著降低, 尤其是其籽粒中表达量较微, 几乎能引起靶基因80%左右沉默。对转基因T₂代植株的高温结实特性和籽粒理化品质的检测结果, PDI基因沉默会引起高温胁迫处理下结实率的大幅度降低, 耐热性显著下降, 但其在常温处理下的结实率与对照之间无显著差异。此外, PDI基因沉默后, 稻米的透明度下降、垩白度增加, 但对籽粒粗蛋白总量和直链淀粉含量的影响不甚明显。