水稻类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因OsCBL8功能的初步研究

 以转正义或反义OsCBL8基因的T3代株系及非转基因对照为材料, 研究了转OsCBL8基因对水稻农艺性状、内源OsCBL8基因表达和幼苗耐盐、耐旱及耐冷性的影响。结果表明, 供试的16个转基因株系的株高、单株分蘖数、单株有效穗数、穗长和百粒重等性状与对照无显著差异, 每穗实粒数和结实率则大都显著或极显著低于对照。部分转基因株系的半定量RT PCR结果表明, 转正义基因显著增强了植株中OsCBL8基因的表达, 而转反义基因则对内源OsCBL8基因的表达具有一定的抑制作用。在盐、干旱和低温等非生物胁迫条件下的生长实验发现, 1个转正义基因株系的耐盐性得到显著增强, 1个转反义基因株系的耐旱性得到显著增强。 讨论了OsCBL8基因在水稻耐非生物逆境方面可能的机理。     

甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草

根据本实验室克隆的甘蔗锌指蛋白ShZP基因cDNA序列,在开放阅读框两侧设计特异引物,通过PCR扩增引入相应的酶切位点,把甘蔗ShZP基因的编码区(大小为725bp)cDNA片段,分别以正向和反向插入到中间载体pCRBI的Prd29A启动子和NOS终止子之间,构建了其正义植物表达载体pCRBIShZP和反义表达载体pCRBIantiShZP.采用冻融法分别将pCRBIShZP和pCRBIantiShZP导入根瘤农杆菌菌株EHA105中,通过农杆菌介导法对烟草进行转化,经过12mg/L的PPT连续抗性筛选,共获得23株抗性植株,对其中的5株转正义基因烟草植株和9株转反义基因烟草植株进行PCR检测,分别获得3株转正义基因的阳性植株和4株转反义基因的阳性植株.PCR检测结果初步证明外源甘蔗锌指蛋白ShZP基因已成功整合到烟草基因组中,这一研究为植物抗逆基因工程研究打下了一定的基础.     

转NPR1和CHR3抗病基因提高大豆对疫霉根腐病抗性研究

为检测GmCHR3和广谱抗病基因NPR1双抗基因转化到大豆吉林30中的遗传稳定性和抗病能力,从而为培育出抵抗疫霉根腐病大豆新品种提供有效参考,以大豆品种吉林30转CHR3抗病基因转化品系JL30+GmCHR3为目标受体材料,以吉林30为对照受体材料,利用农杆菌介导法将NPR1导入受体中.利用常规PCR检测基因转化情况,利用Southern杂交和qRT-PCR技术分别鉴定JL30+GmCHR3受体和双抗基因转化株系T1和T2代中两个基因的整合和表达情况,采用下胚轴侵染法鉴定转基因大豆植株对疫霉根腐病的抗性.PCR研究结果显示:转化元件的启动子35s、终止子Nos、筛选标记基因Bar以及目的基因NPR1全部转入到受体基因组中;NPR1基因以单拷贝的形式在转化植株中完成整合;NPR1基因在大豆植株根、茎和叶中均有表达,其中T1代株系在3个部位的相对表达量分别是2.732,1.614和3.316,T2代株系的相对表达量分别是2.936,2.084和3.864;NPR1基因在各组织中的相对表达量为茎＜根＜叶.CHR3和NPR1双抗基因转化株系对疫霉根腐病表现为高抗,NPR1单抗基因转化株系表现为中抗,非转基因吉林30植株表现为感病.结果说明大豆吉林30转入双价抗病基因GmCHR3和NPR1可以增强其对疫霉根腐病的抗性.     

花粉管通道介导的抗除草剂基因(bar)对大豆的遗传转化

采用花粉管通道介导法将含有bar基因的pPTN140质粒DNA导入8个黑龙江省大豆主栽品种（系）,导入1384朵花,共获得1164粒种子,经2次Basta除草剂筛选后共获得3个品种的除草剂抗性植株8株.对其进行PCR以及PCR-Southern杂交检测均为阳性结果,Southern杂交结果显示,8个除草剂抗性后代植株整合数目不同,其中2株整合单拷贝基因,另外6株分别整合3～8个拷贝的bar基因.对8个抗性植株的后代进行了除草剂抗性分析,D1-D3代均出现除草剂抗性植株,表明bar基因可以在转基因植株后代中遗传,抗性遗传分析结果表明不同株系间以及株系内除草剂抗性缺乏规律性,分离比率不符合孟德尔遗传规律.说明大豆花粉管通道法转化基因存在多拷贝共抑制现象.目前获得除草剂抗性稳定的D3代株系82个.试验说明利用花粉管通道技术进行大豆转化是可行的.     

大豆对SMV SC-13株系群的抗性遗传及基因定位的研究

在接种SC-13株系群的情况下,鉴定了科丰1号×南农1138-2的P1、P2、F1、F2和184个重组自交家系(RIL)的抗性,结果显示,科丰1号(P1)与F1全部表现抗病,南农1138-2(P2)全部表现感病,表明抗性为显性;F2群体和184个重组自交家系出现抗感分离,卡方适合性检测表明F2群体抗感分离符合3:1的比例,重组自交家系抗、感符合1:1分离比率.表明对SC-13株系群的抗性由一对基因控制,以Rsc-13表示.利用已建立的遗传连锁图对Rsc-13进行了连锁分析,结果将抗病基因Rsc-13定位于N8-D1b W连锁群上,并与抗性基因Rn1、Rn3、Rsc-7连锁.     

转铁蛋白基因增强水稻对氧化胁迫与稻瘟病菌的抗性

对转豌豆铁蛋白（pea ferritin,Fer）基因水稻T1代的53个株系进行PCR检测,52个株系能扩增出阳性PCR产物。通过测定光合作用过程中最大光化学通量（Fv/Fm值）分析了由百草枯处理引起的T1代水稻叶片的氧化损害。与未转基因水稻相比,转Fer基因水稻的叶片对氧化胁迫的耐受能力有不同程度的增强。百草枯处理后转基因植株叶片叶绿素含量与水处理叶片相比没有明显下降,而未转基因植株叶片叶绿素含量降低至水处理叶片的20％左右。选取9株对氧化胁迫耐受能力较强的水稻进行了Northern blot分析和子代的稻瘟病抗性测定,其中5株转基因植株Fer mRNA 积累增强。病原菌接种后T2代转基因植株的病斑数量明显少于非转基因植株。表明转Fer基因水稻对氧化胁迫和病原菌有较好的抗性。     

转基因水稻株系的纹枯病抗性分析

对通过基因枪转化获得的41个转水稻碱性几丁质酶和苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因（RC24和β-1,3-Glu）的高世代纯合株系进行纹枯病抗性接菌鉴定,结果表明不同转基因系间抗性存在极显著差异,聚类分析可分为抗、中抗、中感、感病四种类型,但其中92.1%的株系属中抗或中感类型;选择不同抗感类型的代表性株系,测定其几丁质酶活力,结果显示中抗、中感、感病类型转基因株系表达的几丁质酶活力与其纹枯病抗性表现呈现一致性,而抗病类型表达目标基因编码的酶活力低于中抗类型;接菌诱导后,在不同时间或同一植株的不同部位检测,转基因系的几丁质酶活力因其组成性表达而无明显差异,而未转基因的对照品种在诱导后不同时间其几丁质酶活力表达呈“峰”式曲线分布,同一植株不同空间位置的酶活力却无明显差异。     

文摘

芥菜型油菜抗白锈病遗传 用一个抗性品种和两个感病品种杂交研究芥菜型油菜抗白锈病小种2号遗传。温室条件下进行接种试验,F_1对该病的反应与亲本相同表明,抗性呈显性,由核基因控制。F_1植株同抗性亲本回交,对该病的反应与抗性亲本相同,F_1植株同感病亲本回交,抗病与感病的分离比率为1:1。F_2植株的分离比率为3:1。本研究结果揭示,芥菜型油菜对白锈病小种2号的抗性为单基因遗传,可通过早期世代回交将抗性转     

高赖氨酸蛋白基因导入小麦的研究

为了培育高赖氨酸含量的小麦新材料,利用基因枪转化法将辣椒高赖氨酸蛋白Cflr基因导入到小麦品种扬麦16中,轰击了2 500枚小麦幼胚,获得抗除草剂Basta的再生植株176株(遗传转化采用的筛选标记基因为bar基因),经PCR鉴定Cflr基因阳性的转基因植株为23株.T1代幼苗喷洒130 mg·L-1的Basra溶液进行除草剂抗性鉴定,发现T1代幼苗的除草剂抗性出现了分离.PCR-Southern杂交进一步证明外源高赖氨酸蛋白基因Cflr基因已经整合到小麦的基因组中.通过种子赖氨酸含量和总蛋白质含量的测定,发现75.00％的转基因株系的赖氨酸含量高于受体扬麦16,77.78％的转基因株系的蛋白质含量高于受体扬麦16.本试验获得了一批赖氨酸含量提高的小麦转基因株系,这些高赖氨酸含量的转基因株系可进一步用于小麦高赖氨酸分子育种研究.     

hrpZ_(Psta)在转基因大豆中定量表达与疫霉根腐病和灰斑病抗性相关研究

以T5转hrpZPsta基因大豆JN29-705-15和JL30-187为材料,利用实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real Time PCR,qRT-PCR)检测了目标基因在转基因大豆不同组织中的表达量,分别利用下胚轴侵染法和叶面喷施法鉴定疫霉根腐病抗性和灰斑病抗性,并分析目的基因表达量与疫霉根腐病和灰斑病抗性的相关性。结果表明:hrpZPsta基因在大豆的叶、茎、根、籽粒中均有表达,二个株系平均相对表达量分别为8.2/6.1、0.9/0.7、6.5/4.6和0.8/0.7;T5转hrpZPsta基因大豆抗疫霉根腐病和灰斑病能力与野生型相比均有所提高,JN29-705-15对疫霉根腐病抗性从感病提高到中抗,而JL30-187从中抗提高到抗病;hrpZPsta基因在叶中的表达量也与抗灰斑病能力呈正相关,与病情级别呈极显著负相关。试验结果初步证明了外源基因hrp ZPsta在大豆植株中的表达量与受体植株对疫霉根腐病和灰斑病抗性存在一定的相关性。     

转移巴西橡胶树HbCBF1基因提高烟草抗寒能力的研究

通过农杆菌介导的叶盘转化法将巴西橡胶树HbCBF1基因导入到烟草中增强表达。GUS染色和PCR鉴定结果表明,外源DNA片段已成功导入并整合到烟草基因组中。选取3个烟草转基因株系用于进一步鉴定分析,分析表明,转化植株游离脯氨酸含量与对照相比,分别上升了4.2倍、3.1倍和2.5倍,叶绿素A和叶绿素B含量也明显提高。电导率法测定转化烟草的相对存活率分别为19.8%、17.5%、16.3%,高于对照植株的7.7%。以上结果表明,橡胶树HbCBF1基因能够增强非低温驯化植物烟草的抗寒能力,其机理可能是通过促进细胞内容物的积累从而提高细胞的低温防御能力。     

Role of LOX3 Gene in Alleviating Adverse Effects of Drought and Pathogens in Rice

Lipoxygenase 3 (LOX3) is a major component of the LOX isozymes in mature rice seeds. To investigate the role of LOX3 gene under stresses, a plant expression vector containing antisense cDNA of LOX3 was constructed. Rice varieties Wuyunjing 7 and Kasalath were transformed by the Agrobacterium-mediated method and transgenic rice plants were generated. PCR and Southern blot results showed that the antisense LOX3 gene was integrated into the rice genome. Analyses of embryo LOX3 deletion and semi-quantitative RT-PCR confirmed the antisense suppression of LOX3 gene in transgenic plants. The T2 antisense plants of LOX3 were sensitive to drought stress, rice blast and bacterial blight compared with non-transgenic plants. These results suggest that the LOX3 gene might function in response to stresses.     

水稻种胚LOX3基因在逆境胁迫中的作用

LOX3是主要的水稻种胚脂氧合酶同工酶。为了研究水稻LOX3基因在逆境胁迫中的作用,构建了LOX3基因的反义植物表达载体,用农杆菌介导法转化水稻品种武运粳7号和Kasalath,获得了转基因植株。PCR和Southern鉴定证实基因已经导入水稻基因组中,种胚LOX3缺失鉴定和半定量RT PCR分析证实反义RNA抑制了LOX3基因的表达。对T2代转基因植株进行了水分胁迫处理及稻瘟病和白叶枯病的接种鉴定。结果显示,与非转基因对照相比,反义LOX3转基因植株对水分胁迫、稻瘟病和白叶枯病都表现敏感,说明水稻种胚LOX3基因在逆境胁迫反应中发挥一定的作用。     

甘蔗C4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因转化烟草研究初报

将全长6.8 kb含所有内含子及部分5’侧端和3’末端的甘蔗C4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因插入植物目的基因载体pBI121,经农杆菌介导转化获得转基因烟草,PCR检测和dot southern分析证实外源基因已整合进入烟草基因组中。甘蔗C4Ppc基因导入烟草后其叶片PEPC活性有所提高,但提高较小。因此,有必要继续进行克隆目的基因的5’侧端和3’末端获得其完整序列后用于C3作物的遗传转化研究。     

草莓NCED基因正反义表达载体和RNAi载体的构建

根据草莓（Fragaria ananassa Duch）NCED基因序列（GenBank： HQ399498），克隆NCED基因开放阅读框，将该片段插入植物表达载体pBI 121的CaMV 35S 启动子和NOS 终止子之间，构建了正义表达载体pBI 121NCED。克隆NCED基因正义、反义片段和作为内含子的gusA基因片段，以植物表达载体pBI 121为基础，以pCAMBIA2301作为中间载体，通过多次酶切和连接，成功构建了草莓NCED基因RNAi表达载体pBI 121NCEDRNAi和反义表达载体pBI 121NCEDF。经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后，成功将pBI 121NCED、pBI 121NCEDF和pBI 121NCEDRNA 3个重组表达质粒导入农杆菌EHA105中。研究结果为进一步研究草莓NCED基因的功能奠定了基础。     

反义4C基因转化桉树调控木质素生物合成的研究

以桉树主栽品种尾叶桉U6(Eucalyptus uroplrylla)为试材,通过根癌农杆菌介导法,将反义4-香豆酸:辅酶A连接酶基因(4-eoumarate:CoA ligase)导入尾叶桉U6叶盘,经卡那抗性筛选共获得了6株转化植株,其中3株转化植株的RT-PCR和Northern blot结果显示内源4CL基因的表达受到抑制.     

反义 4CL 基因转化桉树调控木质素生物合成的研究

以桉树主栽品种尾叶桉 U6（Eucalyptus uroplrylla）为试材, 通过根癌农杆菌介导法, 将反义 4-香豆酸 ∶ 辅 酶 A 连接酶基因（4-eoumarate： CoA ligase）导入尾叶桉 U6 叶盘, 经卡那抗性筛选共获得了 6 株转化植株, 其 中 3株转化植株的 RT-PCR 和 Northern blot 结果显示内源 4CL 基因的表达受到抑制。     

拟南芥抗病基因RPP8转化烟草及其表达分析

拟南芥的RPP8（at5g43470）基因编码一种NBS—LRR类抗病蛋白,特异性识别病原菌Peronospora parasitica 8。将该基因亚克隆到植物转化载体pBINPLUS上,通过农杆菌介导的方法将其转入烟草（Nicotiana benthamiana）。用PCR方法对转基因植株进行了初步鉴定,再利用RT—PCR分析了RPP8在烟草中的表达情况。结果表明拟南芥RPP8基因能在烟草中正确表达,说明烟草的转录系统能正确识别拟南芥RPP8基因的启动子、外显子和内含子并在mRNA水平进行正确的剪接。对拟南芥RPp8基因在烟草中的表达进行了初步的分析,这对在烟草中进行拟南芥的R基因的功能鉴定与验证提供了借鉴。     

Protection against potato virus Y (PVY) in the field in potatoes transformed with the PVY P1 Gene

Lines of potato cv. Pito transformed with the P1 gene ofPotato virus Y (PVY^o) in sense or antisense orientation were evaluated for resistance to PVY in the field in 1997 and 1998. The transgenic resistance fully protected the crop from infection with PVY^o transmitted by aphids in both years. These plants were not resistant to the field isolates of the PVY^N strain group, which is in agreement with our greenhouse experiments. Consequently, several transgenic lines produced higher yields than the nontransgenic cv. Pito plants. These results showed that the P1 gene-mediated resistance provides significant benefits under conditions were the incidence of infections and damage by PVY^o are considerable.