双T-DNA表达载体转化大豆的研究

利用含有筛选标记基因和目的基因△6-脂肪酸脱氢酶基因的双T-DNA共转化表达载体pLIN61,经农杆菌EHA101介导,采用子叶节转化法转化大豆,使用除草剂Glufosinate作为筛选剂,获得了一批携带有玻璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因的转基因大豆,转化效率为2.0%,共转化频率及实际转化率分别为56.25%、1.12%.PCR检测和Southern杂交结果证明,玻璃苣D6D已经整合到大豆的基因组上.RT-PCR检测结果显示,玻璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因大豆的转录水平上得到了表达.     

利用农杆菌介导的共转化法获得含双Bt基因转基因水稻

利用农杆菌介导的共转化法,将分别携带不同Bt抗虫基因Cry1C*和Cry2A*的两个植物表达载体同时导入吉林省主栽超级粳稻品种吉粳88中,获得598株草丁膦(Basta)抗性独立转化植株。以Cry1C*和Cry2A*特异性引物对独立转化植株进行双引物PCR扩增,结果得到35株Cry1C*和Cry2A*基因双阳性植株,双基因共转化率为6.28%。以目的基因Cry1C*和Cry2A*为探针进行Southern blot分析,获得3个双基因单拷贝株系。利用RT-PCR检测Bt基因在这3个株系中的mRNA表达情况,结果表明两个Bt基因在转录水平上同时得到了有效表达。     

转基因植物中删除选择标记基因的研究进展

选择标记基因广泛应用于植物转基因工程中,然而这些基于除草剂和抗生素类抗性选择标记基因的利用,在转基因筛选和鉴定完成后功能多余。当前转基因植物的标记基因及相关产物对环境污染和食用安全的潜在影响,已经引起了人们的广泛关注。随着转基因技术的不断发展和人们对转基因植物和食品安全性的关注,删除转基因植物中的选择标记基因非常重要。文章着重讨论了植物转基因过程中,选择标记基因的利用,删除选择标记基因的几种方法,包括共转化法、位点特异性重组、染色体内重组、转座子介导的重组、删除叶绿体转化中选择标记基因,以及无选择标记基因植株的直接再生等。同时,还对这些技术的发展作了展望。     

基因枪法介导的转KN2基因小麦的获得及鉴定

【目的】获得转KN2基因的小麦植株,为研究KN2基因对提高转基因小麦抗寒性的作用,以及为利用基因工程提高小麦抗逆性奠定基础。【方法】以弱冬性小麦品种小偃22为供试材料,通过基因枪法,用含有KN2基因的植物表达载体和筛选标记基因bar共转化小麦幼胚愈伤组织,经过除草剂(Phosphinothricin,草丁膦)筛选和愈伤组织分化获得再生植株,并对得到的再生小麦植株进行PCR检测。【结果】采用基因枪法共轰击小偃22的幼胚愈伤组织1 680个,共获得再生植株17株,移栽到花盆中成活15株;根据目标基因序列设计特异引物,对成活的小麦植株进行PCR检测,结果表明获得含有bar基因和KN2基因的转基因阳性植株分别为6株和4株,转化率分别为0.36%和0.24%,bar和KN2的共转化率为0.24%。【结论】KN2基因成功地转入到小麦品种小偃22中。     

荠菜CBF冷诱导途径多价载体的构建和烟草转化

为了研究荠菜CBF抗冷途径多基因共表达对转基因植株耐寒性的影响,通过同尾酶法将CbCBF、CbICE53、CbRCI35以及CbCOR15bP进行结合,构建了CbCOR15bP::CbICE53+pCaMV35S::CbCBF+pCaMV35S::CbRCI35多价植物表达载体并进行了烟草的转化,通过形态观察以及电解质渗透率和相对水含量这两个生理指标的测定显示,转基因植株在4℃和-4℃低温处理情况下,多基因共转化的转基因植株在电解质渗透率和相对水含量与野生型和空载对照之间的差异非常明显,转基因植株在低温下的抗寒冻能力也明显增强,说明CBF途径多基因共转化可以明显提高烟草的抗寒冻能力,此项研究具有一定的实际应用意义。     

无选择标记的甜瓜a-ACO1基因植物表达载体的构建及对烟草的共转化效果

从植物表达载体pCB-aACO1的T-DNA区段上切去nptⅡ基因,构建了无选择标记植物表达载体pCD-aACO1,其T-DNA区段只含有目的基因a-ACO1和GUS基因.从另一植物表达载体pCAMBIA2301的T-DNA区段切去GUS基因,构建了植物表达载体pCAMBIA2302,其T-DNA区段其只含有nptⅡ基因.用这2种新载体共转化烟草,在对40株抗性转基因烟草的PCR检测中,有14株扩增出a-ACO1基因,共转化率为35%.     

用共转化法培育无选择标记转基因植物研究进展

介绍了用农杆菌介导的共转化法培育无选择标记基因转基因植物的原理、方法、影响因素以及其国内外研究进展.     

利用电激共转化法转化橡胶树悬浮细胞的初步研究

利用电激转化法对橡胶树悬浮细胞系进行转化,初步确定卡那霉素的筛选浓度、共转化的实验条件。通过电激共转化法将NPTII、GUS、EGFP和Hb CBF1基因成功导入到橡胶树悬浮细胞并整合到基因组中。通过卡那霉素抗性筛选、GFP荧光观察和PCR验证等方法,确定外源DNA片段转化成功。共筛选得到95个抗性愈伤组织,其中9个愈伤组织经过PCR验证确定整合有外源DNA片段,1个愈伤组织共转化有NPTII和GUS基因。此结果表明电激共转化法可成功应用于橡胶树悬浮细胞转化操作。     

大豆磷高效基因GmPHR1和GmPAP4共转化及新种质创制

磷对大豆生长发育至关重要,土壤有效磷缺乏严重影响其产量和品质。目前已有学者通过转基因手段将磷高效相关基因转入大豆,并获得转基因新材料,但多数集中于单基因转化,而双基因共转化研究甚少。本研究在前期获得转磷高效相关基因GmPHR1、GmPAP4大豆新材料基础上,利用农杆菌介导与常规杂交技术进行双基因共转化,结果发现,采用这2种方案均可实现双基因共转化,获得了经PCR及DNA测序分析验证正确的转GmPHR1与GmPAP4双基因新材料“JD12-PHR1-PAP4”。     

反义Waxy基因共转化籼型杂交稻亲本的初步研究

以籼型杂交稻亲本II32B为供试材料,对根癌农杆菌共转化过程中影响转化效率的因素进行了研究。结果表明：在诱导培养基和分化培养基中附加NAA、KT和6-BA的激素配比可以改进愈伤组织质量,对愈伤组织的形成和苗的分化起决定作用;农杆菌OD600为0.8,侵染时间为10 min是II32B合适的转化参数;潮霉素浓度为30 mg/L是理想的筛选浓度;部分植株经PCR检测为阳性,证明外源目的基因已经整合到转基因水稻的基因组中,从而建立适合于供试水稻材料的遗传转化体系。