中国大菱鲆虹彩病毒(TRBIV)PCR检测方法的建立及其应用

大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus,TRBIV)是中国工厂化养殖大菱鲆的主要病毒性病原之一.本研究提取了该病毒DNA,依据其主要衣壳蛋白基因序列设计了PCR引物,优化了PCR反应参数,建立了TRBIV的PCR检测方法,测试了该方法的特异性和灵敏度,并应用该方法开展了TRBIV的流行情况调查及研究了大菱鲆的外观症状(红体)与TRBIV感染的关系.结果显示,本研究建立的TRBIV PCR检测方法可以从相当于100ng病鱼组织中或103数量级的病毒粒子中检出TRBIV,也可以在不杀死被测鱼的情况下,仅从鱼体中抽取少量血液即可在1天的时间内完成大量样品的TRBIV检测,但不能从健康大菱鲆脾组织和患淋巴囊肿牙鲆的囊肿组织中扩增出任何产物,说明该方法具有很高的灵敏性和特异性;在所调查的山东半岛5家大菱鲆养殖场的19尾大菱鲆中,7尾为TRBIV阳性或弱阳性;具有"红体"症状的大菱鲆应当划分为"病毒性红体病"、"细菌性红体病"和"非病原性红体症"3种不同的类型.本研究为TRBIV的流行情况和传播途径调查、疾病的快速诊断和控制提供了技术手段;调查结果显示TRBIV已遍布山东半岛沿海地区的大菱鲆主产区,在地域上相距较远的多个大菱鲆养殖场流行,今后需要密切关注该病毒的传播和流行.     

东北林蛙种蛙蛙病毒LAMP快速检测

由于环境、气候的恶化以及疾病的侵害,全球两栖动物种群数量呈现出整体衰退的趋势,其中虹彩病毒属蛙病毒科的蛙病毒是不可忽略的原因之一.环介导等温扩增技术（loop-mediated-isothermal-amplification,LAMP）是一种新型的核酸扩增技术,具有特异性强、快速、简便等特点,本研究利用LAMP技术,开发了针对中国东北林蛙种蛙蛙病毒的快速检测方法,针对蛙病毒MCP基因设计出能特异识别靶序列上6个位点的4条特异性引物,在链置换聚合酶（Bst酶）的作用下,62℃扩增30 min.通过对实验参数的优化,扩增后病毒的最低检出数可达到102个拷贝.该方法可用于东北林蛙养殖厂种蛙蛙病毒的临床快速检测,保证种蛙的存活质量和数量.     

水生动物虹彩病毒的分子生物学及研究进展

在水生动物病毒病害中，虹彩病毒引起的系统性疾病占有很重要的地位，而且虹彩病毒能感染鱼类、两栖类及爬行类动物，给全世界水产业带来了重大经济损失。本文拟就虹彩病毒各方面的特性作一叙述。     

原位杂交技术用于虹彩病毒对美国青蛙侵染的诊断

蛙虹彩病毒（Rana grylio virus,RGV)能引起鱼类、两栖类和爬行类水生动物严重的系统性疾病，RGV是从我国患病蛙中分离到一种虹彩病毒。体外扩增的RGV经人工方法感染幼龄美国青蛙（Rana grylio)，运用原位杂交技术，分别对感染1-3d后的蛙心、肺、肾、肠、脾、肝等6种组织进行RGV分子定位和检测，结果显示，在幼蛙的肺和肠中有较强的阳性信号，在其他组织中也检测到RGV的存在。本试验探讨了RGV感染早期在宿主体内的增殖及在不同组织中的分布状况，建立了一种彩虹病毒的早期诊断方法，并为揭示RGV的致病机制奠定了基础。     

罗源湾养殖大黄鱼虹彩病毒的PCR检测

2012年7月至10月间对从福建罗源湾患“白鳃病”的网箱养殖大黄鱼的鳃丝、肝脏、脾脏、肾脏及性腺等器官组织提取的总DNA进行虹彩病毒PCR检测,经序列分析,从患鱼肝脏、脾脏、肾脏获得的两条病毒DNA基因片段ly1、ly2分别与已报道的大黄鱼虹彩病毒(AY779031)和真鲷虹彩病毒(AB104413)高度相似,患鱼病毒阳性率为10%~65%.由此判断,罗源湾发生“白鳃病”并出现陆续死亡情况的养殖大黄鱼可能与感染虹彩病毒有直接关系.     

加强出口鰤鱼鱼苗检疫工作探讨

鰤鱼(俗称:章雄鱼),分布于日本海及台湾以南海域,生长适温为20℃-30℃,春、夏季自南向北洄游,秋、冬季由北往南洄游,鰤鱼的网箱养殖最早起源于日本。自上世纪八十年代以来,每年中秋节过后,海南渔民即开始捕捞野生鰤鱼鱼苗进行网     

一种虹彩病毒感染大菱鲆的病理学研究

对我国虹彩病毒感染的大菱鲆Scophthalmus maximus进行的组织病理和超微病理学研究发现,该病典型的病理学特点是在病鱼的脾脏、肾脏、肠、肝脏、鳃、心脏和皮肤等器官组织内出现嗜碱性的肿大细胞。病毒感染导致患病大菱鲆多个器官组织发生了不同程度的病理变化,其中以脾脏组织的病理变化最为显著,表现为造血组织的严重坏死。此外,肾脏造血组织发生坏死、肠固有膜和黏膜下层出血和水肿、肝细胞水样变性、心肌局灶性坏死以及皮肤真皮层出血并伴有水肿和炎性渗出也是该病常见的组织病理学变化。超微病理研究表明,肿大细胞内有虹彩病毒粒子存在。病毒分布于受感染细胞的胞质、组织间隙以及血管腔内。受感染细胞出现线粒体和内质网等细胞器肿胀、崩解等细胞病理变化。研究认为,病毒感染造成皮下组织血管损伤出血,是虹彩病毒感染的大菱鲆发生＂红体病＂的原因所在。虹彩病毒感染所致的机体严重贫血是患病大菱鲆死亡的主要原因,而主要器官组织的病变使得病鱼器官功能衰竭则可加速鱼的死亡。     

大鲵虹彩病毒贵州分离株MCP基因的克隆与原核表达

根据Gen Bank中大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白MCP(major capsid protein,MCP)基因序列(序列号:KF512820),设计一对特异性引物,以大鲵虹彩病毒贵州分离株基因组DNA为模板,PCR扩增大鲵虹彩病毒MCP基因并测序,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因进行比对,然后将其亚克隆到原核表达载体p ET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后进行Western blot分析。结果显示:PCR扩增出长度为1 392 bp的片段,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因核苷酸序列相似性为99.7%~99.9%,SDSPAGE电泳显示该重组蛋白的相对分子质量约为67×103。免疫原性检测结果表明,该重组蛋白可与兔抗大鲵虹彩病毒阳性血清特异性反应,具有免疫原性。     

RNA干扰技术抑制新家坡石斑鱼虹彩病毒感染细胞多肽ICP46与绿色荧光蛋白融合基因的表达

新加坡石斑鱼虹彩病毒（singapore grouper iridovirus,SGIV）是一种严重的能引起全身性疾病的病原体,对石斑鱼养殖造成了重大的经济损失。将含有SGIV感染细胞多肽ICP46（infected cell polypeptides 46）基因的真核表达载体pEGFP-ICP46转染到胖头鲤细胞（fathead minnow cells,FHM）中进行融合表达,用荧光显微镜观察到ICP46-GFP融合蛋白主要分布于FHM细胞的细胞质中。根据SGIV-ICP46的序列,设计并体外化学合成了特异性干扰SGIV-ICP46的siRNA（siRNA-ICP46）,与pEGFP-ICP46共转染到FHM细胞中,通过荧光显微镜观察不同时间点荧光强度的变化。转染后24~48 h,实验细胞（共转染siRNA-ICP46和pEGFP-ICP46）和阳性对照细胞（共转染siRNA-GFP和pEGFP-ICP46）中的荧光微弱,发荧光的细胞数量较阴性对照（共转染siRNA-Negative和pEGFP-ICP46）少70%左右,但其后实验细胞和阳性对照细胞的荧光强度开始增强,在转染后72 h其与阴性对照组已差别不大。说明体外化学合成的siRNA-ICP46转染后24~48 h可有效抑制FHM细胞中外源导入SGIV-ICP46基因的表达。