TaSPX3基因VIGS沉默表达降低小麦对叶锈病(Puccinia recondite f. sp. tritici)的抗性

为挖掘TaSPX3基因在小麦抗叶锈病中的作用,本研究以前期对叶锈菌感染的小麦转录组数据分析发现的TaSPX3基因受到叶锈菌侵染诱导表达为依据,利用BSMV-VIGS系统沉默中国春和郑麦9023中的TaSPX3基因,利用qRT-PCR技术进一步分析小麦抗病相关基因的转录水平。结果发现TaSPX3基因沉默后,小麦叶锈菌感染加重,降低了小麦对叶锈病的抗性;同时,对侵染过程抗病相关基因转录检测发现,抗病相关基因PR2和CAT的表达水平显著下调。本研究表明TaSPX3基因可能通过调控PR2和CAT基因的表达参与小麦对叶锈病的抗性。     

小麦PDS基因VIGS载体构建体系的优化及验证

为在小麦上进行VIGS体系的优化,根据GenBank中公布的小麦PDS基因序列(FJ517553.1)设计特异引物,利用RT-PCR技术克隆PDS基因片段,以BSMV:γ-2a为原载体,通过酶切将原载体中的2a基因片段替换为PDS基因片段,构建小麦PDS基因的VIGS重组载体BSMV:γ-PDS。经测序确认,其与GeneBank中登录的小麦PDS基因序列同源性为97%。重组载体经本实验室简化改良的方法进行转录模板的处理。与试剂盒所提供的方法相比,本研究将RNA酶孵育处理步骤整合入质粒提取的步骤中,省略了SDS-蛋白酶K孵育处理等步骤,降低了引入新杂质的风险,同时降低了实验成本,节省了时间和精力。体外转录的电泳结果表明,体外转录反应的产物浓度大,条带单一,可用于接种实验。抽穗期小麦穗部接种实验及实时定量PCR的结果均表明,小麦内源PDS基因被有效沉默,证实了优化的重组载体BSMV:γ-PDS体系的有效性,奠定了利用VIGS载体侵染抽穗期小麦体系优化的基础。     

番茄对晚疫病的株龄相关抗性及Ph-3的抗性机制

目前已明确番茄抗晚疫病R基因表现明显的株龄相关抗性(Age-related Resistance,ARR),但抗晚疫病QTL的抗性规律尚不明确。以携带抗晚疫病基因Ph-3的栽培种番茄(Solanum lycopersicum)‘CLN2037B’和野生种醋栗番茄(S.pimpinellifolium)‘L3708’以及易感病材料栽培种番茄(S.lycopersicum)‘LA2818’为对照,对含有抗晚疫病QTL的多毛番茄(S.habrochaites)‘LA2099’、‘LA1033’和‘LA1777’是否也存在株龄相关抗性进行了分析。结果表明,携带抗晚疫病QTL的3个材料的6叶期和9叶期植株病情级数均比3叶期明显降低,表明QTL抗性与株龄相关。利用乙烯、水杨酸和茉莉酸素合成或缺失的突变体和病毒诱导基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)技术,初步明确了乙烯和水杨酸参与6叶期Ph-3基因介导的对晚疫病的抗性,而茉莉酸不参与。     

通过GbF3’H基因单独沉默及其与GbCHI和GbDFR基因共沉默研究其在海岛棉中抗枯萎病功能

【目的】通过沉默海岛棉GbF3’H基因及共沉默GbF3’H、GbCHI和Gb DFR基因,研究其在海岛棉抗枯萎病中的作用。【方法】以海岛棉抗病材料06-146为研究对象,GhCLA1基因为阳性对照,空载体为阴性对照,构建海岛棉TRV2-Gb F3’H沉默载体,协同课题组前期构建的TRV2-CHI和TRV2-DFR载体,利用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing,VIGS)分别进行Gb F3’H基因单独沉默以及GbF3’H、GbCHI和Gb DFR这3种基因共沉默试验。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real time-polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析各处理样品中基因沉默情况;设置室内接种枯萎病菌试验测定病情指数,分析各沉默材料对枯萎病的抗性差异。【结果】q RT-PCR结果显示,海岛棉GbF3’H基因沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量比空载体对照低,Gb F3’H、GbCHI和GbDFR这3种基因共沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量均比空载体对照低。病情指数调查结果显示,野生型<空载体对照相似文献   

小麦 TaGRF4基因分析与功能鉴定

旨在研究小麦 TaGRF4基因的生物学功能，利用生物信息学技术分析小麦 TaGRF4基因结构及其与其他作物的进化关系，利用实时定量检测 TaGRF4在不同发育时期叶片和不同区段叶片中的表达丰度，同时检测外源GA处理条件下 TaGRF4的表达情况，最后利用BSMV-VIGS体系使 TaGRF4的3个同源基因同时沉默，研究 TaGRF4沉默对叶片生长发育的影响。结果表明， TaGRF4是玉米 ZmGRF10的同源基因，在幼嫩叶片和叶尖部位的表达量最高，而且对外源GA处理响应迅速； TaGRF4沉默后新生叶片明显伸长，说明 TaGRF4与 ZmGRF10有类似的生物功能，能够抑制叶片的伸长生长。     

利用VIGS技术研究广藿香醇合酶基因PatPTS的功能

广藿香精油主要存贮在植物地上组织的盾状腺毛中。提取广藿香（马来西亚品系）叶片的总RNA后,通过PCR技术扩增得到广藿香醇合酶基因（PatPTS）的全长cDNA序列,共编码552个氨基酸,与GenBank中已报道的印度广藿香中广藿香醇合酶的氨基酸序列存在3.6%的差异。使用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）,选取PatPTS作为沉默目的基因,在广藿香中构建病毒诱导基因沉默（VIGS）体系,进一步利用该体系在广藿香中鉴定PatPTS基因的功能。病毒侵染广藿香叶片后,分别选取不同的时间点,使用GS-MS与qRT-PCR检测PatPTS催化产物和转录水平的变化,结果发现：β-广藿香烯、β-榄香烯、石竹烯、广藿香醇等倍半萜成分的含量在VIGS侵染后第2周明显下降,1周和3周效果不明显;PatPTS转录本下降趋势与其调控的倍半萜含量变化趋势类似;表明PatPTS基因负责了广藿香精油主要倍半萜成分的合成。说明广藿香中VIGS体系已初步建立,并在侵染植物2周后诱导基因沉默和干扰次生代谢产物合成的效果最好,为在广藿香中快速研究基因功能打下基础。     

番茄青枯病抗性两个相关基因功能的初步鉴定

对抗性番茄材料‘Hawaii 7996’分别接种强致病力青枯菌（RsH）和中等致病力青枯菌（RsM）后,利用双向电泳技术找到了两个差异表达蛋白质--谷胱甘肽S转移酶L3和Remorin 1蛋白。在利用携带八氢番茄红素脱氢酶基因PDS的TRV重组病毒载体通过叶片浸润法证明VIGS体系可行后,进一步利用该技术沉默上述两个蛋白质的对应基因GST-L3和Rem-1,并用半定量RT-PCR检测沉默效果。结果表明,分别沉默GST-L3和Rem-1的番茄植株抗性减弱,在接种中等致病力青枯菌（RsM）后青枯病发病率和病情指数都明显高于对照植株,说明基因GST-L3和Rem-1与番茄对青枯病的抗性相关。