油棕病毒诱导的基因沉默体系的建立及优化

为开展油棕油脂代谢调控相关基因鉴定研究,以油棕八氢番茄红素脱氢酶基因（phytoene desaturase gene,PDS）作为报告基因,探索以病毒载体TRV为载体在油棕胚状体上应用病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）的可能性,并对油棕胚状体VIGS体系的相关参数进行优化。结果显示：以EHA105为菌种、侵染菌液OD600=0.5、侵染时间5 min、乙酰丁香酮（AS）质量浓度20 mg/L、共培养48 h、侵染后培养时间为12 d能取得最佳的基因沉默效果。在此基础上,利用优化后的VIGS体系对油棕二酰甘油酰基转移酶基因（diacylglycerol acyltransferase gene,DGAT）进行沉默,取得了预期的基因沉默效果。     

黄花菜八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的克隆及VIGS转化表达验证

为了拓宽对黄花菜基因功能研究的技术体系,本研究以黄花菜‘大同黄花’为试验材料,基于转录组数据库检索和PCR技术克隆得到了黄花菜HcPDS基因完整编码序列,序列全长1710 bp,编码570个氨基酸。该基因编码的蛋白质具有PDS基因家族典型的Phytoene desat结构域,分子量为63.719 72 kD,等电点为7.53,是亲水不稳定性蛋白。通过序列比对,发现HcPDS基因与水仙、芦笋等植物中的PDS基因具有较高的同源性。通过构建黄花菜病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系,黄花菜幼苗被侵染后,接种pTRV2-HcPDS的植株新叶出现不完全的光漂白现象,叶片中的HcPDS基因表达量相比接种TRV2空载的阴性对照和空白对照植株分别下降了73.33%和71.72%。空白对照和阴性对照植株叶片则无光漂白现象出现,且空白对照和阴性对照的HcPDS基因表达量相比无显著差异。所构建的黄花菜VIGS体系可有效沉默HcPDS基因,为黄花菜功能基因的鉴定与分析奠定了技术基础。     

大豆单锌指蛋白基因GmSZFP的克隆及其在SMV与寄主互作中的功能

【目的】由大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV）引起的大豆花叶病是世界性大豆病害之一,利用病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）技术研究GmSZFP在大豆与SMV互作过程中发挥的功能,为深入探讨其分子机制奠定基础。【方法】以大豆品种冀豆7号与SMV毒株SC-8、N3组成的亲和、不亲和组合为试验材料,运用生物信息学预测GmSZFP的分子结构特征;以酵母转录激活试验检测其转录因子活性;借助实时定量PCR（RT-qPCR）验证GmSZFP在大豆与SMV互作中转录水平的表达特征;结合VIGS技术探究GmSZFP在大豆与SMV互作过程中的功能。【结果】通过PCR克隆GmSZFP的CDS区,序列全长为1 071 bp;氨基酸序列分析和酵母转录激活试验发现GmSZFP为C₂H₂型锌指蛋白转录因子,且具有转录激活活性;RT-qPCR结果显示,GmSZFP受SMV的强烈诱导,在亲和组合与不亲和组合中的表达模式不同,在不亲和组合中,GmSZFP呈先上升后下降的表达趋势,其表达水平明显高于亲和组合,若在接种病毒前给叶片预注射咪唑,GmSZFP的表达水平降低,并与亲和组合相近,说明GmSZFP在转录水平响应SMV的侵染并受胞内H₂O₂信号调控;利用VIGS技术沉默GmSZFP后,发现接种部位胼胝质的积累水平较对照大大降低,RT-qPCR检测胼胝质合酶基因GmGSL7c和GmGSL12b的表达量较对照降低,胼胝质水解酶基因BG的表达量较对照增加;在基因沉默植株叶片上点接种SMV后72 h,病毒向外扩散至2 mm,在96 h时病毒扩散至3 mm,而对照组叶片在接种点外始终未能检测到SMV外壳蛋白CP的表达;摩擦接种SMV后10 d,在基因沉默植株的上位叶表现出花叶、失绿和卷曲等感病症状,并检测到CP的表达,说明沉默GmSZFP后,SMV在胞间扩散和长距离运输的能力均增强。【结论】大豆GmSZFP是典型的C₂H₂型单锌指蛋白,GmSZFP在大豆抵抗SMV侵染过程中发挥正调控作用。     

病毒诱导的基因沉默

    "病毒诱导的基因沉默"(virus-induced gene silencing,VIGS)一词最早用于描述被病毒侵染的植物的"恢复"现象,是一种植物抗病毒侵染的自然机制,现在已被开发成通过插入目的基因片段的重组病毒抑制植物内源基因表达的遗传技术,用于基因功能分析VIGS由小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)驱动,siRNA单链与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC)结合后,特异性地和与siRNA同源的靶标RNA结合,并降解RNA模板已有源于15种不同类型病毒的VIGS载体得到开发和应用在VIGS栽体中插入的目的片段、重组VIGS病毒载体的植物导入方法、沉默处理时的寄主生育期、沉默处理后的植物培育条件等均显著影响VIGS的效率作为一种新型的基因鉴定和功能研究技术工具,VIGS具有无需事先知道目的基因全长序列、获取表型迅速、无需构建转基因植株等诸多优点,已越来越广泛地被应用于植物基因功能研究     

苏麦3号小麦穗部病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系的建立及验证

为了探讨利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系在小麦穗部进行基因沉默的可行性,用大麦条纹花叶病毒诱导苏麦3号小麦穗部PDS基因的转录后沉默,再接种禾谷镰刀菌进行抗性鉴定。结果表明,与接种空载BSMV∶00的对照相比,接种BSMV∶PDS的小麦穗中PDS基因表达量下调了77%(P0.05)。接种BSMV∶00的小麦穗受到赤霉病菌侵染后,穗部平均病小穗数和DON毒素含量分别为2.75个和4.55μg/g,与接种无菌水对照无显著差异(P0.05)。说明在苏麦3号穗部VIGS系统中,通过接种病毒能使靶标基因沉默;接种赤霉病菌后,苏麦3号病小穗数和DON毒素含量不受接种病毒的影响,对赤霉病菌的抗性保持不变,建立的VIGS体系可以应用于小麦赤霉病抗性候选基因的功能分析。     

桑树PDS基因VIGS转化体系的构建与鉴定

[目的]建立桑树的病毒诱导基因沉默(VIGS)转化体系,为桑树功能基因的分析研究提供技术支持.[方法]以丰驰桑为试验材料,克隆含BamH I和Xba I酶切位点的八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因片段,经Xba I和BamH I双酶切后与烟草脆裂病毒(TRV)连接构建重组病毒载体pTRV2-PDS,转化农杆菌GV3101后通过压迫注射方式侵染桑树幼苗叶片.[结果]克隆获得的桑树PDS基因干扰片段346 bp,与改造后的TRV质粒连接可成功构建携带桑树PDS基因的重组病毒载体pTRV2-PDS.桑树叶片被侵染15 d后,接种重组病毒载体pTRV2-PDS桑树的第二轮真叶开始出现叶片白化现象,侵染20 d后,白化现象沿叶脉向四周逐渐扩散,叶片呈现明显的白化表型.实时荧光定量PCR检测结果显示,重组病毒载体pTRV2-PDS侵染的桑叶PDS基因相对表达量仅为阴性对照(pTRV2)的58%,二者差异极显著(P<0.01),表明桑树PDS基因表达被有效抑制.[结论]利用TRV构建的桑树VIGS体系能有效沉默PDS基因,使桑树叶片呈现明显的白化症状,即可用于后续的桑树功能基因鉴定.     

病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)在豌豆基因功能研究中的应用

病毒诱导的基因沉默技术（vIGs）是近年发展起来的一种通过抑制基因转录研究植物基因功能的快速方法,豌豆早褐病毒（PE—BV）的VIGS技术已经被成功的应用于豌豆发育调控基因功能的研究。该文在概述VIGS原理研究进展的基础上,对基于PEBV的VIGS技术流程进行总结,并提出改善其缺陷的方法和合理的数据分析处理方式,认为基因的沉默效率与基因在调控网络中的位置,上下游基因的影响及基因间的功能冗余有关。     

棉花VIGS病毒载体的构建及其在抗病基因功能鉴定的应用

【目的】利用农杆菌介导的VIGS基因沉默技术,研究陆地棉抗病相关基因在棉花抗黄萎病中的功能。【方法】利用分子生物学技术构建VIGS病毒载体,建立VIGS病毒诱导沉默体系;利用此体系将棉花中的一个钙依赖蛋白(CDPK)基因,通过农杆菌介导在陆地棉中沉默,根据此基因沉默植株在病原菌环境下的发病情况研究该基因在棉花抗病中的功能。【结果】利用包含有GhCPK抗病基因片段的VIGS病毒载体的农杆菌侵染棉花子叶,病毒载体上的目的基因片段由RNA聚合酶识别并合成双链RNA(double stranded RNA,dsRNA),dsRNA由Dicer酶识别并于其它RNA形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC),RISC对内源GhCPK mRNA进行识别和切割作用,内源GhCPK mRNA降解而发生基因沉默。GhCPK基因沉默导致棉苗对黄萎病敏感性增加,证明GhCPK基因参与调控棉花抗病功能。【结论】病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)能够快速有效的研究GhCPKs基因在棉花抗病中的功能。     

基于小麦品种‘洛夫林10’的VIGS体系研究

为将病毒介导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)技术应用于小麦-叶锈菌互作体系及小麦基因功能研究,本试验在优化适宜BSMV繁殖并引起发病的环境条件基础上,将病毒载体转染小麦品种‘洛夫林10’(简称L10)叶片并接种叶锈菌生理小种,发现接种病毒对叶锈菌侵染反应型没有影响,通过构建TaCAMTA4与TaATG8的BSMV-VIGS载体,将体外转录病毒转染小麦,以感染BSMV:PDS的L10作指示,在指示叶片变白后,经半定量RT-PCR检测,发现目的基因的表达量明显降低,表明用VIGS技术能够成功沉默L10中的目的基因,这一结果为进一步研究小麦与叶锈菌互作过程中小麦基因的功能及分子机制奠定了基础。     

病毒诱导基因沉默在蔬菜作物上应用的研究进展

近年来,病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术作为一种研究植物基因功能的反向遗传学手段,因其构建简易、成本低、周期短等优势在功能基因组领域的研究更为广泛和深入。在蔬菜作物生长发育、逆境胁迫、物质合成和代谢调控等相关基因功能的研究中,VIGS作为一种快速、高效、高通量的基因沉默新技术发挥了重要作用。因此,利用VIGS技术开展蔬菜作物新基因的挖掘、抗病抗逆基因功能鉴定、作物改良、分子育种等相关研究的意义重大。目前,在蔬菜作物中已经成功建立了多种以病毒为载体的VIGS体系,但该体系仍然存在一些不足。随着研究者对VIGS作用机制的深入探究和病毒载体的不断开发,VIGS在蔬菜作物上的应用范围越来越广阔。本文通过梳理近年来国内外基于VIGS技术研究茄果类、瓜类和叶菜类等蔬菜基因功能的研究报道和发展趋势,对VIGS技术机制、病毒载体的应用以及VIGS技术进展做了简要解析,同时对比分析了VIGS技术与RNA干扰技术（RNA interference,RNAi）以及当前较为流行的CRISP/CAS9技术的优缺点。重点介绍VIGS技术在蔬菜果实发育和抗病中的应用,对该技术在蔬菜作物物质代谢、激素调控、生物与非生物胁迫应答方面的最新进展进行了综述,并列举了利用VIGS技术研究茄果类、瓜类、叶菜类和豆类蔬菜靶基因功能和沉默表型的案例,总结了VIGS技术在研究蔬菜作物基因功能时缺乏适合的VIGS载体,缺乏有效的病毒载体侵染方法,在某些组织中难以系统性沉默,沉默效率低,VIGS固有的局限性等方面存在的问题和不足。同时提出了未来VIGS技术在开发特异性与稳定性更高的病毒载体,选择高效的基因片段,建立适合更多寄主范围的病毒载体等方面的研究方向。对VIGS技术用于蔬菜基因功能分析、蔬菜作物改良、分子育种以及生产不携带外源基因的蔬菜品种育成等方面的应用前景进行了展望,以期为开展蔬菜作物生长发育、次生代谢、逆境胁迫等相关基因功能研究以及突破制约VIGS技术的关键因素研究提供思路与参考。     

VIGS基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望

随着作物基因组测序工作的陆续完成,大量影响作物重要农艺性状的基因功能等待挖掘.由于缺少高效的遗传转化方法,多种作物的基因功能研究进展缓慢.病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术不依赖遗传转化,通过病毒载体接种即可在当代植物体内实现对靶向基因的沉默.VIGS技术因其起...     

抗马铃薯Y病毒病的VIGS生防剂发酵条件及施用方法优化

病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silence,VIGS）是植物病毒病防治方法之一,能够有效防治马铃薯Y病毒病。以VIGS表达载体发酵液对烟草马铃薯Y病毒病的防治效果为检测指标,筛选最佳发酵液发酵所需的培养基、发酵条件和施用方法。结果表明：VIGS表达载体发酵液最优培养基是YEP培养基;最优发酵条件为装瓶量60 mL/200 mL、初始pH 7.0、培养温度30℃、振荡培养24 h;施用方法以 “原液稀释100倍”、“剪叶后喷施+移栽时灌根”和“含PVY CP和HC-Pro基因片段的VIGS载体发酵液混合使用”的施用效果最佳。上述结果为抗马铃薯Y病毒病的VIGS生防剂发酵提供了理论依据,也为其田间应用打下基础。     

叶用莴苣热激蛋白基因LsHsp70-2711的克隆及高温胁迫下的功能分析

【目的】通过克隆Hsp70相关基因,并利用VIGS分析叶用莴苣热胁迫下Hsp70表达量和形态变化,为解析热激蛋白基因Hsp70在高温胁迫下的响应机制及分子机理奠定基础。【方法】通过同源克隆及RACE技术,获得叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-2711的cDNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在不同温度和不同高温时间下的叶用莴苣热敏品种‘P-S11’和耐热品种‘G-S59’的表达差异,确定基因和高温的相关性。根据VIGS技术,构建p TRV-LsHsp702711瞬时沉默载体,转化农杆菌GV1301,注射法侵染叶用莴苣叶片,三周后经PCR鉴定得到阳性植株。对照组和阳性组在基因表达和形态上进行对比,对照植株和阳性植株热胁迫和干旱处理后再次分析LsHsp70-2711的表达特性,观测形态变化。【结果】LsHsp70-2711 cDNA全长为2 226 bp,开放阅读框为2 154 bp,编码718个氨基酸,与拟南芥(NP_187864.1)、番茄(NP_001266213.1)、水母雪莲花(AAB99745.1)等物种的Hsp70同源性达到80%以上,证明此基因属于Hsp70家族。根据qRT-PCR结果,高温胁迫下该基因在两个品种中的表达均上调,在耐热品种中总体表达水平均高于热敏品种,耐热品种LsHsp70-2711的表达量最大值出现在42℃、60 min,37℃、60 min时热敏品种基因表达量达最大值,且在42℃高温下热敏品种‘P-S11’中基因表达随着胁迫时间的增加受到抑制,而耐热品种‘G-S59’则能长时间保持较高的表达水平,此结果和田间两品种间耐热差异表现相符合。亚细胞定位显示,LsHsp70-2711主要在细胞质中。将构建好的载体侵入叶用莴苣,鉴定后获得阳性植株。由定量PCR结果可知,未进行胁迫处理的阳性植株与对照株相比,LsHsp70-2711表达量下降,茎长明显增长。热胁迫和干旱处理后的阳性植株LsHsp70-2711表达量显著低于对照植株,高温处理对LsHsp70-2711的影响大于干旱胁迫。【结论】LsHsp70-2711属于Hsp70基因家族,其与叶用莴苣耐热性相关。研究结果为解析叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-2711在叶用莴苣高温抽薹方面的功能提供了理论支持。     

病毒诱导的精氨琥珀酸合成酶基因沉默对棉花氮代谢的影响

以棉花为研究对象,利用转录后基因沉默技术(VIGS)将棉花精氨琥珀酸合成酶(GhASS1)基因沉默,研究沉默后植物的氨基酸、多胺、一氧化氮(NO)等含氮化合物的代谢变化。结果表明:盐胁迫可以诱导棉花精氨琥珀酸合成酶(GhASS1)瞬时上调表达,GhASS1沉默严重影响氨基酸的合成,除天门冬氨酰(Ans)外,其他蛋白质组成型氨基酸质量分数显著降低,NO质量摩尔浓度和多胺(PAs)质量分数下降,棉花植株生长发育迟缓。GhASS1沉默对棉花精氨酸脱羧酶基因(GhADC)、棉花鸟氨酸脱羧酶基因(GhODC)表现出强烈的抑制作用,进而影响植物多胺的代谢和耐盐能力。高浓度盐环境下,沉默体系精氨酸(Arg)和NO质量摩尔浓度上升,GhARG1表达上调。GhASS1沉默对于植物是致命的,GhASS1是尿素循环和氨基酸代谢的关键环节,GhASS1沉默使GhARG1、GhADC和GhODC表达下调,严重影响整个氨基酸代谢,NO质量摩尔浓度,腐胺(Put)和精胺(Spm)质量分数显著降低,N代谢受阻,植株发育不良,生长迟滞,棉花中存在Arg-NO通路。     

在中国大豆品种上创建ALSV诱导的基因沉默体系

【目的】在中国大豆品种上建立以苹果潜隐球形病毒（apple latent spherical virus,ALSV）为载体的基因沉默体系,为中国大豆品种的基因功能和遗传育种提供一种简便、省时、易操作的技术体系。【方法】构建以农杆菌介导接种的ALSV病毒侵染性克隆载体。从大豆品种威廉姆斯82（Williams 82）中特异扩增327 bp的八氢番茄红素脱氢酶（GmPDS）基因cDNA片段,插入病毒载体pALSV2。通过农杆菌浸润法将病毒载体导入模式植物本氏烟（Nicotiana benthamiana）,17 d后富集病毒粒子,摩擦接种大豆第一轮真叶,以接种病毒空载作为对照组,持续观察测试大豆植株系统叶表型,并结合逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）或荧光定量PCR（qRT-PCR）检测ALSV衣壳蛋白基因（CP）和GmPDS的表达水平。【结果】ALSV﹕GmPDS接种大豆品种威廉姆斯82和南农1138-2,20 d后,前者系统叶未见白化表型,而后者系统叶出现明显的白化表型;qRT-PCR检测结果表明,发生白化的南农1138-2植株中GmPDS的表达水平显著降低,未出现白化表型的威廉姆斯82中GmPDS的表达水平没有出现显著变化。在此基础上,采用相同的方法,测试了ALSV在其他9种大豆品种中诱导GmPDS的沉默效率,发现在南农47、安豆203、祥斗4号、中黄13、山宁29、齐黄34等大豆品种上接种ALSV﹕GmPDS后植株系统叶均产生白化表型,而菏豆12、中黄311和山宁16等3个品种的GmPDS均不能诱导有效沉默。【结论】构建了农杆菌介导的ALSV病毒载体,利用本氏烟扩繁富集ALSV病毒,将提纯的病毒粒体摩擦接种大豆真叶,在多个中国大豆品种上成功建立了基因沉默体系。     

本氏烟NbMBF1c的克隆、表达及在TMV侵染过程中的功能

【目的】烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）是危害茄科、十字花科、葫芦科等农作物的重要病毒,给农业生产造成了巨大损失。通过分子克隆获得本氏烟（Nicotiana benthamiana）多蛋白桥梁因子1c（multiprotein bridging factor 1c,MBF1c）,综合应用生物信息学、细胞生物学以及分子生物学手段,明确NbMBF1c的抗病毒功能和机制,为作物的抗病毒育种提供理论依据。【方法】根据Sol Genomics Network中报道的NbMBF1c序列全长,设计引物克隆NbMBF1c全长序列;使用GeneDoc及MEGA X对NbMBF1c蛋白和其他物种中的同源蛋白序列进行比对并构建系统进化树;利用生物信息学分析NbMBF1c的基因特征和蛋白结构;使用实时荧光定量PCR检测其组织表达及其在TMV侵染中的表达;利用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）技术沉默NbMBF1c后通过摩擦接种TMV-GFP,明确NbMBF1c对病毒侵染的影响;构建pART27-GFP-NbMBF1c和pART27-Myc-NbMBF1c瞬时过表达载体,在本氏烟叶片中表达融合蛋白GFP-NbMBF1c后在共聚焦显微镜下观察亚细胞定位,表达融合蛋白Myc-NbMBF1c后接种病毒观察TMV-GFP侵染情况;采用实时荧光定量PCR检测沉默NbMBF1c后相关激素基因的表达,分析NbMBF1c影响病毒侵染的机制。【结果】NbMBF1c全长441 bp,编码146个氨基酸,包含一个保守结构域HTH（helix-turn-helix）;系统发育分析表明,NbMBF1c与绒毛状烟草（Nicotiana tomentosiformis）MBF1c（XP_009614458.1）亲缘关系最近;NbMBF1c的表达具有特异性,在根中的表达量最高,其次是茎、叶和花;NbMBF1c定位于细胞质和细胞核中;沉默NbMBF1c会显著影响本氏烟株高,出现矮化等症状,接种TMV-GFP第5天时,沉默处理相较于对照组植株新叶病毒含量更高;瞬时过表达Myc-NbMBF1c融合蛋白,在注射叶接种TMV-GFP后,病毒侵染减少,但NbMBF1c并不与TMV组分互作;沉默NbMBF1c后,脱落酸（abscisic acid,ABA）合成关键酶基因NCED3、脱落酸受体PYL1、ABA信号转导因子ABAI1和蛋白激酶SnRK2E的表达量显著上调;茉莉酸（jasmonic acid,JA）合成途径AOS1上调表达,茉莉酸信号通路上的受体COI1下调表达。【结论】本氏烟MBF1家族NbMBF1c的表达受TMV侵染诱导,且主要定位于细胞质和细胞核。NbMBF1c作为植物抗TMV的正调控因子抑制病毒在本氏烟上的侵染。NbMBF1c不通过与TMV组分互作来抑制病毒侵染,而是通过调控植物激素的产生和信号传导来抑制病毒侵染。     

Application of virus-induced gene silencing for identification of FHB resistant genes

Virus-induced gene silencing(VIGS) showed several advantages to identify gene functions such as short experimental cycle, more broad hosts, etc. In this study, the feasibility and efficiency of employing Barley stripe mosaic virus(BSMV)-based VIGS system to evaluate Fusarium head blight(FHB) resistance were explored in wheat. With variable conditions tested, it showed that the maximal silencing efficiency 78% on spike was obtained when the recombinant BSMV was inoculated on flag leaf at flagging stage. However, the plant may reduce its own immunity to FHB when inoculated with BSMV. To induce this impact, different Fusarium graminearum strains were tested and SF06-1 strain was selected for FHB resistance evaluation. Using this system, Ta AOC, Ta AOS, and Ta OPR3 involved in jasmonic acid(JA) signaling pathway were identified to positively regulate FHB resistance, which was underpinned by the results when silencing Ta AOS in wheat by stable transgenic plants.     

果树病毒载体研究进展

植物病毒载体作为重要的研究工具被广泛运用于蛋白表达、基因沉默等研究,当前普遍使用的是以烟草花叶病毒载体等为代表的草本植物病毒载体,但其大多不能侵染果树,且稳定性较差,容易丢失插入的外源基因,因此该类载体无法满足果树等多年生植物研究的需要。近年来新兴的果树病毒载体可解决这些难题,为此作者对果树病毒载体的研究进展和发展方向进行综述。当前国内外取得的研究成果主要包括：（1）通过掌握柑橘衰退病毒、柑橘叶斑病毒、李痘病毒、苹果潜隐球形病毒、葡萄病毒A和葡萄卷叶伴随病毒等果树病毒的传播途径、寄主范围、致病力分化、基因功能和表达策略等特性,采用体外转录或农杆菌介导的方式获得了上述果树病毒的全长侵染性克隆。在此基础上,通过在病毒外壳蛋白基因与其邻近的上游基因之间插入外源基因（包括荧光蛋白基因和β-葡萄糖醛酸酶基因等报告基因）,并用该病毒外壳蛋白基因的启动子或其他异源启动子驱动外源基因表达的方式,将上述6种果树病毒的全长侵染性克隆改造成为病毒载体;（2）运用果树病毒载体明确了柑橘衰退病毒、柑橘叶斑病毒、李痘病毒、苹果潜隐球形病毒和葡萄卷叶伴随病毒在植株中的分布、移动规律,及其在细胞中的定位。探寻了柑橘衰退病毒在大翼来檬上产生茎陷点症状的原因,以及交叉保护防治柑橘衰退病的主要机理。果树病毒载体还被作为病毒诱导的基因沉默载体用于基因功能和防病研究;（3）通过选用本地已经存在,且无虫传能力的弱毒株,以及对控制病毒致病和媒介传播能力的基因进行敲除、突变可以解决果树病毒载体研发过程中所遇到的安全风险。由于有些果树病毒仅分布于植株的韧皮部,因此限制了其作为病毒载体在植株中表达外源基因的范围,但由这类果树病毒构建的病毒载体稳定性极高,并且通过添加分泌信号肽基因等方式可以扩大表达产物在植株中的分布和作用范围,因此其在果树病毒研究方面仍然具有很高的应用价值。此外,采用不同病毒来源的异源启动子代替同源重复区来驱动外源基因的表达,可以进一步提高果树病毒载体的稳定性。     

一种适于PCR检测病毒诱导基因沉默番茄植株的微量DNA提取方法

【研究目的】为了寻找一种适用于病毒诱导的基因沉默番茄叶片PCR检测的快速、简单、成本低的DNA提取方法。【方法】笔者根据PCR反应的要求,用改良的CTAB法,实现了微量番茄叶片基因组DNA的快速提取。【结果】提取基因组DNA所用的组织量虽少,所得的DNA经过电泳检测虽有降解,但足以用于PCR检测,以其作模板扩增中国番茄黄化曲叶病毒诱导的硫黄素酶(Su)基因沉默植株中病毒组分中的DNAmβ和1.7A,片段大小分别为500bp、1300bp。测序结果证明是相应基因的部分片段。【结论】该方法的材料不需要使用液氮,可以单人大批量提取,并在基因沉默的番茄植株中能稳定而准确的规模化PCR检测。