大片形吸虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A的原核表达及不同时期表达水平分析

【目的】克隆大片形吸虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A(Ser/Thr protein phosphatases 2A,PP2A)基因并构建原核表达载体,获得原核表达蛋白,为探究PP2A基因功能及其在大片形吸虫的发育中的作用奠定基础。【方法】提取大片形吸虫成虫虫体组织总RNA,应用RT-PCR方法扩增PP2A基因的完整编码区序列,并以双酶切的方式连接pET-28a(+)载体;经酶切、测序鉴定后获得阳性质粒pET-28a-PP2A,将pET-28a-PP2A重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化;通过SDS-PAGE及Western blotting检测大片形吸虫PP2A基因的表达效果;应用实时荧光定量PCR检测PP2A基因在大片形吸虫虫卵、囊蚴、6周龄童虫和成虫阶段中的表达情况。【结果】克隆的大片形吸虫PP2A基因编码区序列长1 161 bp,编码386个氨基酸,分子式为C₁₉₈₀H₃₁₀₅N₅₃₅O₅₆₆S₂₄,分子质...     

绵羊支原体HSP70的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立绵羊支原体(Mycoplasma ovis)的血清学检测方法,根据GenBank收录的绵羊支原体HSP70蛋白C端的基因序列(登录号：CP006935.1),构建了重组原核表达质粒。通过原核表达获取重组蛋白,并将纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立了绵羊支原体间接ELISA抗体检测方法。结果显示,成功构建了绵羊支原体HSP70蛋白的重组原核表达质粒;重组蛋白在大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞中,同时以可溶性蛋白和包涵体蛋白的形式表达;以重组蛋白作为包被抗原建立的绵羊支原体间接ELISA抗体检测法,抗原包被最佳浓度为4μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 000。建立的ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,为绵羊支原体的检测及试剂盒的开发提供了技术支持。     

小花尺蛾触角感器扫描电镜观察

利用扫描电镜对小花尺蛾Eupithecia abietaria debrunneata Staudinger雌雄成虫触角感器类型?形态与分布进行研究, 结果表明:小花尺蛾触角鞭亚节第50~64节的各亚节感器种类无差异, 触角长度?感器长度和数量存在雌雄二型现象?触角上感器类型为10类17种, 包含B?hm氏鬃毛(Ⅰ~Ⅱ)?叉形感器?鳞形感器?毛形感器(Ⅰ~Ⅲ)?刺形感器?锥形感器(Ⅰ~Ⅱ)?耳形感器(Ⅰ~Ⅲ)?腔形感器?腔锥形感器(Ⅰ~Ⅱ)和栓锥形感器?雄蛾触角显著短于雌蛾触角, 雄蛾毛形感器Ⅰ?毛形感器Ⅲ的长度显著长于雌蛾, 数量显著多于雌蛾, 雌蛾刺形感器数量显著多于雄蛾?在鳞翅目昆虫上首次发现耳形感器Ⅲ, 结合已有感器功能的报道, 对感器类型?形态和分布进行比较, 并分析其功能?     

两种梢斑螟幼虫口器结构及感器扫描电镜观察

  目的  探究赤松梢斑螟幼虫和冷杉梢斑螟幼虫的食物谱差异机制,为两种梢斑螟幼虫取食行为差异提供科学依据。  方法  利用扫描电子显微镜对两种梢斑螟幼虫的口器及感器的超微结构进行观察。  结果  扫描电镜结果表明,两种梢斑螟幼虫口器结构存在差异。赤松梢斑螟幼虫的“内唇”有2处骨化,而冷杉梢斑螟幼虫有3处;赤松梢斑螟幼虫的上颚切齿多于冷杉梢斑螟幼虫;赤松梢斑螟幼虫的吐丝器口大于冷杉梢斑螟幼虫。两种梢斑螟幼虫口器上共有5种感器和1种角质齿,分别是毛形感器、刺形感器、锥形感器、栓锥形感器、指形感器和刺状角质齿。但是,两种梢斑螟幼虫在同一感器的大小和感器分布上存在差异。在赤松梢斑螟幼虫下颚须端部数第1节和第2节连接处着生的锥形感器为Ⅱ型,而冷杉梢斑螟幼虫此处着生的锥形感器则为Ⅲ型。两种梢斑螟幼虫在相同感器之间的长短、形状也有差异。  结论  两种梢斑螟幼虫口器结构的差异是造成取食行为不同的原因之一。此外,相同感器之间长短、形状的差别,对两种梢斑螟幼虫的取食行为也有一定影响。两种梢斑螟幼虫口器上分布的5种感器,在虫体感知寄主植物体组织部位硬度、寄主表面挥发物、气流等方面发挥重要作用,有助于幼虫进行寄主定位。此研究明确了两种梢斑螟幼虫的口器结构及感器种类、数量及分布,并对感器功能进行了讨论。以期为进一步探讨两种梢斑螟幼虫的食物谱差异机制奠定基础。      

边缘无形体MSP2的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立可检测边缘无形体（Anaplasma marginale）的血清学检测方法,该研究根据GenBank收录的边缘无形体MSP2基因序列（登录号：EU526889）,构建重组质粒pET28a-MSP2,原核表达获得pET28a-MSP2重组蛋白,将纯化后的蛋白作为抗原,建立间接ELISA检测方法。结果显示,该研究建立的间接ELISA方法,抗原最佳包被浓度、血清最佳稀释度和酶标二抗最佳工作浓度分别为8μg/mL、1∶400和1∶2 000,特异性、灵敏性和重复性良好。本试验成功表达并纯化了边缘无形体的MSP2蛋白,并建立了边缘无形体抗体间接ELISA方法,为边缘无形体的监测和诊断提供参考。     

应用双抗体夹心ELISA检测罗非鱼感染无乳链球菌后组织和血清中抗原变化

为了建立快速有效的罗非鱼无乳链球菌病早期诊断方法以便服务于及时疫情预警，试验通过双抗体夹心ELISA法确定罗非鱼不同组织(血液、脑、肝、头肾和脾)无乳链球菌阴/阳性临界值后，对感染无乳链球菌不同感染剂量(50cfu/m L、100cfu/m L、200cfu/m L和400cfu/m L)、不同感染时间(12 h、24 h、48 h、72 h、96h、120 h、144 h、168 h)罗非鱼的不同组织样品中的病原抗原进行检测。结果显示，双抗体夹心ELISA法确定脑、头肾、肝、脾及血清中抗原的阴/阳临界值分别为:0.192、0.198、0.196、0.173和0.163;感染后12 h处理组脑组织OD₄₅₀值均显著高于对照组(P<0.01);除24 h外感染组头肾组织OD₄₅₀值远大于对照组，且差异具有时间依赖性(P<0.01);感染后24 h肝组织OD₄₅₀值达到峰值，96 h恢复正常值;感染后12 h，脾脏组织OD₄₅₀值显著高于对照组(P<0.05);感染后12h血清OD     

梨形虫和伊氏锥虫双重PCR检测方法的建立

为了建立梨形虫(Piroplasmida)和伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)的双重PCR检测方法，试验根据梨形虫的18S rRNA基因和伊氏锥虫的kDNA基因设计两对特异性引物，以吕氏泰勒虫和伊氏锥虫阳性样品DNA为模板进行单重PCR和双重PCR,并对双重PCR的退火温度进行优化，对本研究建立并优化的双重PCR方法进行特异性试验、敏感性试验及临床样品的检测。结果表明：本研究建立的双重PCR方法能够扩增出350 bp和600 bp的特异性目的条带，而无浆体、肝簇虫、弓形虫和埃立克体样品均呈阴性，梨形虫和伊氏锥虫最低检测浓度分别为54.70 fg/μL和14.30 fg/μL,用本试验建立的方法对临床样品的检测结果与对照方法(巢式PCR)检测结果一致。说明本研究成功建立了灵敏、快速、简便、特异性高的双重PCR检测方法，能够用于梨形虫和伊氏锥虫的临床检测及流行病学调查。