犬弓首蛔虫雄虫cDNA文库构建及EST分析

为构建T.canis雄虫cDNA文库,采用Trizol法提取T.canis雄虫的总RNA,合成cDNA,连接到λTripEx2载体上,通过包装蛋白对连接产物的包装,接种到大肠杆菌XL-1-Blue中进行原始文库和扩增文库的滴度测定.经质量鉴定表明:初始文库的滴度为5.25×106 pfu·mL-1,扩增后文库的滴度为6.90×109 pfu ·mL-1.文库的插入片段大小在500～2 000 bp,平均片段大小为1 000 bp,重组率为99.47％.所有指标均显示已成功构建了T.canis雄虫的cDNA文库.利用该文库获得了189条5'有效表达序列标签(EST).对ESTs拼接后代表了101个Unigenes,含有27个Contigs和74个Singletons.其Unigenes在GenBank中的序列号为HO348195～HO348295.同源性分析检索到有56个Unigenes与已知基因同源,其中具有已知或推测功能的基因有40个,未知功能基因有16个,未比对上的基因45个.未比对上的基因与NR数据库中的蛋白序列没有任何意义的匹配,为研究中发现的新基因.这些结果为进一步开展犬弓首蛔虫功能基因及分子机制研究奠定了基础.     

犬弓首蛔虫卵黄原蛋白基因的克隆及表达分析

为克隆犬弓首蛔虫(T.canis)的卵黄原蛋白(YP)基因,本研究根据T.canis cDNA文库中的EST数据,采用RT-PCR方法扩增T.canis的YP基因(TcF-YP),并克隆至pGEM-T载体中进行测序。测序结果表明,TcF-YP基因片段大小为492 bp,编码163个氨基酸残基。同源分析显示,TcF-YP基因与猪蛔虫的卵黄原蛋白基因同源性最高,为78%。同时对该基因在T.canis雌虫、雄虫和雌虫各组织的表达谱进行研究,结果显示TcF-YP基因只在T.canis雌虫中高量表达,是雌虫特异的基因。对雌虫各组织的基因表达谱分析显示TcF-YP基因在子宫和肠中高量表达,在卵巢中有极微量的表达。本实验为TcF-YP基因的功能研究奠定了基础。     

弓形虫多表位PLGA纳米疫苗的研究

构建弓形虫多表位PLGA纳米疫苗并评估其可行性,预测弓形虫TgMIC3蛋白的B、T淋巴细胞优势抗原表位,联合抗原表位SAG1₍(238-256))、GRA7₍(20-28))和AS15,构建出新型多表位肽,用生物信息学工具对其理化性质、三级结构和分子对接能力等特征进行分析;原核表达并纯化多表位重组蛋白(multi-epitope protein, MEP),通过Western blot鉴定纯化效果;搭建MEP-PLGA纳米递送体系,对纳米颗粒进行表征。结果表明,多表位肽为亲水性蛋白非过敏原,具有一定抗原性,抗原表位均呈现在蛋白表面,能与MHC分子H-2-Dd稳定结合;可在BL21(DE3)大肠埃希氏菌表达系统中稳定表达,并能被特异性抗体所识别;构建的MEP-PLGA纳米递送体系包封为54.42%,纳米颗粒饱满,大小均一。成功设计并构建出弓形虫多表位PLGA纳米疫苗,为弓形虫新型纳米疫苗的研发奠定了基础。     

黄鳝胃瘤线虫线粒体cox1基因的多态性研究

为了解渝西地区黄鳝胃瘤线虫分离株线粒体细胞色素C氧化酶第I亚基(cox1)的遗传变异情况及与其他科线虫的种群遗传关系,本研究对该地区黄鳝胃瘤线虫cox1部分序列进行了克隆测序和进化分析.结果表明渝西地区6株胃瘤线虫分离株的cox1序列长度一致,均为441bp;各分离株之间的相似性为97.5%~100%.种系发育树表明,6个胃瘤线虫分离株均位于同一分枝.由于胃瘤线虫cox1序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记.本研究结果为胃瘤线虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定了基础.     

犬弓首蛔虫性别相关基因Tc-vit、Tc-iom、Tc-tpk、Tc-stp在不同生殖器官中的差异表达分析

为对犬弓首蛔虫(T.canis)免疫抑制卵巢信息蛋白(Tc-iom)、卵黄原蛋白(Tc-vit)、酪氨酸蛋白激酶(Tctpk)和丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(Tc-stp)四个性别相关基因进行差异表达分析。本研究采用SYBR Green I qRT-PCR方法检测Tc-vit、Tc-iom、Tc-tpk、Tc-stp在T.canis雌虫卵巢、输卵管、子宫和雄虫精巢、贮精囊、输精管的转录情况。结果显示,Tc-vit在雌虫卵巢、输卵管和子宫中均有转录,在雄虫精巢和贮精囊中也有转录,但在输精管中无转录;Tc-iom在雌虫卵巢、输卵管和子宫中高水平转录,在雄虫精巢和贮精囊中转录量较低,输精管中无转录;Tc-tpk在雄虫精巢和贮精囊中的转录明显高于其他生殖组织;Tc-stp在雄虫精巢和输精管中转录量较高,在雌虫卵巢、输卵管和子宫中转录量较低。本试验为T.canis性别相关基因的进一步研究奠定了基础。