肠道免疫相关的猪富含半胱氨酸肠蛋白2三维建模、分子特征及mRNA表达的组织分布

本研究利用广泛用于肠道感染机制研究的IPEC-J2细胞系探究poCRIP2在猪胃肠道炎症中的作用。在识别poCRIP2基因全长序列的基础上研究poCRIP2的有关特征,同时对其组织表达模式进行分析,并建立有效的poCRIP2三维结构模型以解释其功能,了解poCRIP2在细菌感染过程中的免疫作用及其与NF-κB通路的关系。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术从猪心获得poCRIP2的全长序列;利用Primer Premier5.0和NCBI Primer BLAST程序设计了特异性引物对,采用保家基因β-肌动蛋白（β-actin）对结果进行归一化处理,测试CRIP2基因在猪体内的组织分布;采用生物信息学方法对poCRIP2的特性进行分析,构建poCRIP2蛋白模型;利用ROBETTA服务器,以高度同源的小鼠LIM-homeodomain protein islet 1（Isl1）（PDB：4 JCJ）为模板,模拟poCRIP2的三维结构;用PROCHECK和ProSA对模型进行了分析;应用Procheck对蛋白质折叠进行立体化学和拓扑分析,并应用ProSA对蛋白质折叠进行评价;使用PyMOL程序对建模结果进行评估,分析poCRIP2的保守结构域;设计肠道感染试验,分析poCRIP2在肠道免疫中的功能。结果表明,从猪心获得的poCRIP2 cDNA全长序列为1 118 bp,poCRIP2蛋白与人和小鼠的同源性分别为94.23%和93.75%,它还含有两个保守区（LIM-TLP和LIM-CRP）。poCRIP2的组织表达模式分析表明,poCRIP2在所有组织中均有表达,其中在小肠、肺、胃、脾和肌肉等中表达较低。poCRIP2在革兰阴性菌作用下的表达水平比对照组高1~2倍,但NF-κB通路在同一作用下被激活,无抑制作用,poCRIP2可能不与NF-κB通路相互作用,而与其它通路共同作用于肠道免疫。本研究成功获得了猪CRIP2基因的全长序列,poCRIP2的组织表达模式表明,poCRIP2与人CRIP2相似,建立了可靠的三维结构模型,基于该模型推测poCRIP2中包含的功能主要由β折叠和α-螺旋结构实现,革兰阴性菌感染肠道后poCRIP2能被显著上调,poCRIP2应不依赖于NF-κB通路,在肠道免疫中起其他作用。