LINC24065在体细胞核移植牛中的异常表达

旨在揭示DLK1-DIO3印记域上一个新的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)LINC24065在自然繁殖牛(natural reproduction,NR)与体细胞核移植牛(somatic cell nuclear transfer,SCNT)中的组织表达与印记状态,对进一步了解DLK1-DIO3印记域在供体核重编程中的作用提供一定的理论基础。本研究以自然繁殖牛的大脑组织为试验材料,利用RACE和RT-PCR技术,在牛的DLK1-DIO3印记域内鉴定了一个新的印记的lncRNA基因,命名为LINC24065。用基于SNP(single nucleotide polymopisms)的RT-PCR产物直接测序方法分析LINC24065在自然繁殖牛和体细胞核移植牛组织中的表达及印记状态。序列分析发现,LINC24065编码6个可变剪接体,并在自然繁殖牛被检测的7个组织中都表达,而在体细胞核移植牛组织中没有检测到可变剪接体LINC24065-V3,且其它5个剪接体呈现组织特异性表达。印记状态分析发现,LINC24065在自然繁殖牛和体细胞核移植牛的7个组织中均为单等位基因表达,但在体细胞核移植牛的大脑组织中出现了与其他组织亲本来源不同的单等位基因表达。研究结果说明,LINC24065基因在体细胞核移植牛的大脑中出现了印记紊乱,并且剪接体在组织中的表达也发生了改变。以上研究结果说明LINC24065基因与体细胞核移植牛的发育异常有关。     

DNA甲基化调控牛AQP1基因的胎盘特异性印记

为揭示牛AQP1（aquaporin 1）基因在不同组织及胎盘中的印记状态，以及DNA甲基化修饰在印记中的调控机制，本研究采用基于SNP的PCR产物直接测序的方法，对32头健康雌性成年荷斯坦奶牛心组织及15个自然分娩后的胎盘试验样本进行检测，确定了5头杂合子个体牛和3个杂合子胎盘，对其组织（心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪）和胎盘进行AQP1等位基因表达分析及印记状态分析，利用亚硫酸氢盐测序法分析AQP1基因位于启动子和第一个外显子区的CpG岛在牛心、肝组织、2个胎盘和对应精子中的DNA甲基化状态。结果发现，在杂合子牛被检测的7个组织中，AQP1基因呈现双等位基因表达；而在胎盘中，AQP1基因为单等位基因表达。通过分析杂合子胎盘对应的亲本基因型，发现AQP1基因为母源等位基因表达，即父源印记。进一步比较分析AQP1基因启动子区CpG岛在牛组织、胎盘及对应精子中的甲基化状态，在双等位基因表达的心脏、肝脏组织中，该区域未发现差异甲基化区（differentially methylated regions，DMR）；而在单等位基因表达的胎盘中，存在差异甲基化区，同时父源等位基因精子中为重甲基化状态。以上结果说明，牛AQP1基因为胎盘特异性单等位基因表达的父源印记基因，且AQP1基因位于启动子和第一个外显子区的CpG岛甲基化修饰参与调控牛胎盘的印记表达；在被检测的组织中为双等位基因表达。