经猪血管内皮细胞多次传代的CSFV E2基因的遗传变异研究

【目的】研究猪瘟病毒(CSFV)E2基因在猪脐静脉血管内皮细胞中多次传代后的遗传变异情况,为CSFV的致病机理研究提供理论依据。【方法】分离并培养猪脐静脉血管内皮细胞,接种猪瘟病毒石门株脾毒后继续培养,染毒细胞经3次连续传代后全部死亡、脱落,收集每代细胞并提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增CSFVE2基因。将获得的目的基因克隆入T载体并转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒,进行PCR和BamHⅠ、HindⅢ酶切鉴定,将阳性的重组质粒进行测序,并用DNAStar软件进行序列分析。【结果】扩增出了E2基因,重组质粒PMD18-T-E2的PCR和双酶切鉴定结果表明,E2基因与pMD18-T载体连接成功。各代猪脐静脉血管内皮细胞中CSFVE2基因之间的核苷酸序列同源性为99.4%~99.9%,氨基酸序列同源性为98.9%~99.8%;各代猪脐静脉血管内皮细胞中的CSFVE2基因与标准病毒石门株之间的核苷酸序列同源性为98.9%~99.3%,氨基酸序列同源性为98.9%~99.2%。【结论】猪瘟病毒石门株在猪血管内皮细胞上传代的过程中E2基因无明显的变异,能保持遗传的稳定性。     

猪支气管黏膜上皮细胞的分离培养和传代研究

利用气管-支气管扎结灌注酶冷消化法分离气管黏膜上皮细胞,比较胰蛋白酶和链霉蛋白酶消化效果,并研究含不同细胞生长因子和血清浓度的培养体系来寻找经济、易重复的气管上皮细胞最适培养技术。用抗8/18细胞角蛋白免疫组化法鉴定气管上皮细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡来分析本研究中气管上皮细胞最大传代次数。研究结果表明胰蛋白酶消化气管所得的目的细胞量小、活性差、细胞贴壁和生长困难,链霉蛋白酶灌注冷消化法可获得数量大、活性高、纯度好的目的细胞;基础的上皮细胞培养体系中含低浓度血清、转铁蛋白和人表皮生长因子可以有效保证气管上皮原代和传代生长。本研究所分离的气管上皮细胞可连续传到第6代,传代细胞活性好、纯度高,可为进一步的气管上皮细胞永生化研究提供材料和奠定技术基础。     

TGF-β1基因真核表达载体的构建及在猪脐静脉内皮细胞中的表达

应用RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞扩增转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）全基因,构建含有TGF-β1基因及EGFP报告基因的真核表达质粒pEGFP-C1-TGF-β1。采用脂质体法转染体外培养的猪脐静脉内皮细胞（SUVECs）后,通过直接荧光观察pEGFP-C1-TGF-β1融合蛋白在细胞中的分布定位,并通过RT-PCR、间接免疫荧光方法检测TGF-β1基因在SUVECs中的表达。结果在转染后1周观察到绿色荧光,RT-PCR、间接免疫荧光法检测TGF-β1表达均为阳性。本研究成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP-C1-TGF-β1,且TGF-β1基因在SUVECs中获得表达。