鮰爱德华菌外膜微孔蛋白ompN1、ompN2和ompN3基因生物信息学分析及截段基因的原核表达与其抗原性检测

根据GenBank中鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)外膜微孔蛋白N(outer membrane porin protein,OMP)基因序列(NC_012779.2)设计引物,以鮰爱德华菌Ms12基因组DNA为模板,经PCR扩增后克隆至pMD19-T载体,将阳性克隆菌送公司测序。测序结果通过生物信息学软件对ompN1、ompN2和ompN3序列的氨基酸序列相对分子质量、分子式、信号肽、跨膜区、亲/疏水性、B细胞表位进行预测,并构建系统发育树;根据去信号肽的B细胞表位相对集中区域设计特异性引物,经PCR扩增后,将截段序列克隆至pMD19-T载体,鉴定成功后克隆至原核表达载体pET32a(+)并转化至BL21(DE3)/Rosseta(DE3)进行IPTG诱导表达,最后用兔抗鮰爱德华菌血清对重组蛋白OmpN1、OmpN2和OmpN3进行免疫原性检测。结果显示扩增得到ompN1(1 143bp)、ompN2(1 056bp)和ompN3(1 053bp)的序列,获得的基因登录号分别为KJ831564、KJ831565和KJ831566。经生物信息学分析显示,OmpN1、OmpN2和OmpN3蛋白分子式分别为C1940H2993N543O622S7、C1817H2723N497O579S5和C1896H2843N519O563S7,相对分子质量大小分别为44 100、40 900和41 800,均为含有1个信号肽和跨膜区的疏水性蛋白,具有1个革兰阴性细菌OM_channels超家族结构域,是1种嵌入型的膜外蛋白;SDS-PAGE电泳检测发现,诱导表达的融合重组蛋白均以包涵体的形式出现在沉淀中,大小分别约为61 800、58 700和59 100;Western-blot分析表明,重组蛋白OmpN1、OmpN2和OmpN3均能与兔抗鮰爱德华菌全菌血清结合,表明鮰爱德华菌外膜微孔蛋白N具有亚单位疫苗开发的潜力。     

海豚链球菌重组C5a肽酶对斑点叉尾鮰的免疫保护性研究

采用饱和硫酸铵法对斑点叉尾鮰IgM进行粗提,用亲硫树脂对IgM进行纯化,将纯化的IgM免疫家兔,并用ELISA检测兔抗斑点叉尾鮰IgM抗体效价;制备重组C5a肽酶(pSCPI),分别用1、2和3 μg/g的抗原免疫斑点叉尾鮰,以PBS作为对照;测定了第21、28、35、42和49天斑点叉尾鮰产生的特异性抗体的水平,并于免疫后第4周用海豚链球菌DGX07株进行攻毒。结果显示:通过亲硫树脂亲和层析后得到了较纯的IgM重链和轻链,分别约70 ku和27 ku,浓度达到6.4 mg/mL,免疫家兔后的兔抗斑点叉尾鮰IgM抗体效价达1∶51200;重组蛋白pSCPI免疫斑点叉尾鮰后第3周抗体水平开始增加,第4周达到峰值,第5周后开始下降,且3 μg/g浓度组第4周抗体水平最高,但与2 μg/g浓度组第4周抗体水平差异不显著;攻毒实验显示,3个组14 d平均累计死亡率分别为 47.5%、45%和47.5%,平均相对保护率分别为40.63%、43.75%和40.63%,且死亡鱼体内分离到唯一海豚链球菌。以上结果表明重组pSCPI蛋白具有较好的免疫保护作用,能够作为海豚链球菌亚单位疫苗的候选之一。     

海豚链球菌重组C5a肽酶对斑点叉尾(鱼回)的免疫保护性研究

采用饱和硫酸铵法对斑点叉尾(鱼回)IgM进行粗提,用亲硫树脂对IgM进行纯化,将纯化的IgM免疫家兔,并用ELISA检测兔抗斑点叉尾(鱼回)IgM抗体效价;制备重组C5a肽酶(pSCPI),分别用1、2和3μg/g的抗原免疫斑点叉尾(鱼回),以PBS作为对照;测定了第21、28、35、42和49天斑点叉尾(鱼回)产生的特异性抗体的水平,并于免疫后第4周用海豚链球菌DGX07株进行攻毒.结果显示:通过亲硫树脂亲和层析后得到了较纯的IgM重链和轻链,分别约70 ku和27 ku,浓度达到6.4 mg/mL,免疫家兔后的兔抗斑点叉尾(鱼回)IgM抗体效价达1∶51200;重组蛋白pSCPI免疫斑点叉尾(鱼回)后第3周抗体水平开始增加,第4周达到峰值,第5周后开始下降,且3 μg/g浓度组第4周抗体水平最高,但与2 μg/g浓度组第4周抗体水平差异不显著;攻毒实验显示,3个组14 d平均累计死亡率分别为47.5％、45％和47.5％,平均相对保护率分别为40.63％、43.75％和40.63％,且死亡鱼体内分离到唯一海豚链球菌.以上结果表明重组pSCPI蛋白具有较好的免疫保护作用,能够作为海豚链球菌亚单位疫苗的候选之一.