Matrix蛋白和G蛋白双位点突变型水泡性口炎病毒的构建及生物学活性观察

重组水泡性口炎病毒(Vesiclar stomatitis virs,VSV)是一种具有良好应用前景的病毒载体,可应用于制备疫苗和治疗肿瘤,但该载体仍存在安全性问题,高剂量注射实验动物可导致产生神经毒性.为减低乃至去除野生型VSV的致病性,作者针对VSV毒力因子,构建了Matrix蛋白和G蛋白双位点突变型重组VSV,该病毒敲除了原来Matrix蛋白的第51位精氨酸和G蛋白C末端的28个氨基酸.相比野生型VSV,新病毒的致病性显著降低.试验也证实这个致弱的病毒是由于2种不同弱化机理共同作用所致,即Ⅰ型干扰素作用和复制能力减低.新型VSV病毒载体有希望成为一个更安全、有效的疫苗载体.     

白香猪群体血液蛋白多态性及遗传变异度的分析

本试验采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，检测了白香猪群体的血液中血红蛋白(Hb)，转铁蛋白(Tf)，后白蛋白(Po)，后转铁蛋白(Ptf）4个蛋白座位的多态性。其中Tf、Po、Ptf发现了多态。计算了群体多样性指数和平均位点杂合度，以及群体内亲缘小组之间的欧氏几何遗传距离。表明该群体具有一定的纯度，但遗传变异性仍较大。     

氰戊菊酯对Trichoplusia ni细胞活力的影响

以不同浓度的氰戊菊酯处理昆虫细胞T richop lusia n i(T n),并用台盼兰染色、3-(4,5-D im ethy lth iazo l)-2,5-d ipheny ltrazo lium brom ide(M TT)还原试验及流式细胞仪检测等方法对T n细胞活力进行测定。结果显示,氰戊菊酯浓度大于17.5μm o l/L处理的T n细胞形态、活力均发生了明显改变。在台盼兰染色实验中,氰戊菊酯浓度≥17.5μm o l/L时,T n细胞死亡率升高到29.69%以上,极显著高于对照(P<0.01);在M TT还原实验中,当氰戊菊酯浓度≥17.5μm o l/L时,T n细胞对M TT试剂的还原物吸光值降低,细胞相对活力较对照极显著下降(P<0.01);用流式细胞仪检测的结果也证实,氰戊菊酯浓度为25μm o l/L时,死亡与凋亡细胞数明显高于对照。     

白香猪内脏器官乳酸脱氢酶同功酶的比较研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对成年白香猪的肺、肝、脾、肾和胰脏组织的乳酸脱氢酶(LDH)进行分离,结果显示:它们均含有5条LDH同功酶谱带。经生物图象处理系统扫描定量得出:LDH1,LDH2,LDH3,LDH4和LDH5各组分在肺脏的百分含量的排列顺序:LDH5>LDH2>LDH1>LDH3>LDH4,M亚基∶H亚基为62.93%∶37.08%;在肝脏中百分含量的排列顺序为:LDH5>LDH2>LDH1>LDH3>LDH4,M亚基∶H亚基为49.52%∶50.48%;在脾脏中百分含量排列依次是:LDH5>LDH2>LDH4>LDH3>LDH1,M亚基∶H亚基为52.41%∶47.59%;在肾脏中百分含量多少的次序是:LDH1>LDH2>LDH4>LDH3>LDH5,M亚基∶H亚基为19.00%∶81.00%;在胰脏中百分含量顺序是:LDH1>LDH2>LDH5>LDH3>LDH4,M亚基∶H亚基为32.86%∶67.14%。以上结果提示:LDH同功酶在不同的内脏组织中各谱带及亚基组成与含量的不同,它们反映了相应组织的中乳酸和丙酮酸间转化代谢过程的差异,由此保证了机体糖代谢中LDH所催化反应的正常协调进行。     

香猪PIT-1基因内含子多态性的研究

采用PCR和DNA测序方法,对香猪及对照猪种(上海白猪、大约克夏猪)的PIT-1基因进行了单核苷酸多态性(SNP)分析,并采用RT-PCR方法对3个猪种PIT-1基因的表达水平进行了半定量分析。结果显示:香猪在DNA序列的963位(位于第4内含子)和1429位(位于第5内含子)分别发生G→A突变,而对照猪种在这2个位置未发生突变;香猪PIT-1基因表达水平显著低于上海白猪和大约克夏猪(P<0.05)。结论:香猪第4和第5内含子的两处突变可能会造成PIT-1基因表达量下降,最终可能导致香猪的生长受到影响。     

基质蛋白第221、226位氨基酸位点发生突变的重组水泡性口炎病毒构建和致病性研究

重组水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)是一种具有良好应用前景的病毒载体,可用于制备疫苗和治疗肿瘤,但该载体可导致实验动物产生神经毒性,因此其使用仍存在安全性问题。为减低乃至去除野生型VSV的致病性,对该病毒基质蛋白M的第221、226位氨基酸进行了定点突变,制备了新型重组VSV,并围绕新型重组病毒的致病性展开了体外和体内试验。在体外试验中,221、226双位点突变重组VSV病毒(VSVM221,226)的复制能力相比野生型VSV(VSVXN2)降低可达20倍,且激发IFN-β达(871±1.3)pg/m L。在体内试验中,接种VSVM221,226小鼠体重下降仅约(8.9±0.2)%和(12.3±0.4)%,而接种VSVXN2小鼠体重下降高达(32.6±0.5)%和(30±2)%,且有死亡现象发生。试验结果表明,相比VSVXN2以及221、226单位点突变VSV,VSVM221,226的致病性显著降低,其致弱效应可能是由于病毒感染有效激活宿主细胞产生Ⅰ型干扰素所致。VSVM221,226有希望成为一个安全、有效的疫苗载体。     

香猪垂体特异性转录因子基因及其相关基因表达水平的半定量分析

采用RT-PCR方法对香猪及对照猪种(上海白猪、大约克夏猪)PIT-1基因和相关基因(GH、PRL和TSH-β基因)的mRNA扩增,并以β-actin为内参照进行基因表达水平的半定量分析。结果表明,香猪PIT-1基因及GH、TSH-β基因的表达水平均显著低于上海白猪和大约克夏猪(P<0.05),香猪与上海白猪、大约克夏猪在PRL基因表达水平上的差异也接近显著水平。研究结果提示,香猪的PIT-1基因可能存在着突变,从而使其PIT-1基因的表达水平降低,减弱了PIT-1蛋白对于GH、PRL及TSH-β基因转录和表达的激活功能,导致香猪生长缓慢和矮小性。     

白香猪内脏器官乳酸脱氢酶同功酶的比较研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对成年白香猪的肺、肝、脾、肾和胰脏组织的乳酸脱氢酶(LDH)进行分离,结果显示:它们均含有5条LDH同功酶谱带.经生物图象处理系统扫描定量得出:LDH1,LDH2,LDH3,LDH4和LDH5各组分在肺脏的百分含量的排列顺序:LDH5＞LDH2＞LDH1＞LDH3＞LDH4,M亚基∶H亚基为62.93%∶37.08%;在肝脏中百分含量的排列顺序为:LDH5＞LDH2＞LDH1＞LDH3＞LDH4,M亚基∶H亚基为49.52%∶50.48%;在脾脏中百分含量排列依次是:LDH5＞LDH2＞LDH4＞LDH3＞LDH1,M亚基∶H亚基为52.41%∶47.59%;在肾脏中百分含量多少的次序是:LDH1＞LDH2＞LDH4＞LDH3＞LDH5,M亚基∶H亚基为19.00%∶81.00%;在胰脏中百分含量顺序是:LDH1＞LDH2＞LDH5＞LDH3＞LDH4,M亚基∶H亚基为32.86%∶67.14%.以上结果提示:LDH同功酶在不同的内脏组织中各谱带及亚基组成与含量的不同,它们反映了相应组织的中乳酸和丙酮酸间转化代谢过程的差异,由此保证了机体糖代谢中LDH所催化反应的正常协调进行.     

本科实验课程研究生助教的管理实践与思考

研究生作为实验课程助教可缓解实验教学师资力量的短缺,但实验课程助教工作量大、薪资偏低,因此需要加大助教招聘的宣传力度,做好助教的培训工作,帮助他们更好地投入助教工作。建立严格合理的考核与评优制度,鼓励助教参与实验课程教学改革,更好地发挥研究生助教在实验教学中的作用,并使研究生的科研能力和综合能力进一步提高,达到双赢的效果。     

表达猪流行性腹泻病毒纤突蛋白的重组水泡性口炎病毒构建和鉴定

为表达猪流行性腹泻病病毒(porcine epidemic diarrhea,PEDV)纤突蛋白,利用Mega7基于PEDV纤突蛋白氨基酸序列进行遗传进化分析,选择新发流行毒株纤突蛋白基因,以重组水泡性口炎病毒(rVSV_MT)为载体,在rVSV_MT基因组G和L间插入目的基因,通过反向遗传学技术拯救VSV_MT-S△19重组病毒,Western blot和RT-PCR鉴定重组病毒是否成功表达PEDV纤突蛋白,采用一步生长曲线鉴定VSV_MT-S△19在Vero细胞中的生长特性,并与弗氏佐剂混合后肌肉注射小鼠探究其在动物体内的免疫效果。遗传进化分析发现,插入rVSV_MT的纤突蛋白基因序列PEDV/CHN/SH-2012-5属于PEDV新发流行毒株GⅡ型; RT-PCR分析重组病毒表达纤突蛋白基因无突变; Western blot鉴定显示出PEDV纤突蛋白和VSV病毒特征条带;一步生长曲线表明重组病毒VSV_MT-S△19体外复制滴度可达108TCID50/m L,与VSV_MT-GFP无显著性差异(P> 0. 05);小鼠动物试验结果表明,重组病毒成功激发PEDV中和抗体产生,与对照PBS接种组差异显著(P<0. 05)。研究表明,利用重组水泡性口炎病毒(rVSV_MT)为载体表达GⅡ型PEDV纤突蛋白能有效激发机体产生高水平中和抗体,为PEDV亚单位疫苗的研制提供了理论和实践依据。