华北大黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HoCDA5的分离及定位分析

为了获得华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)幼虫几丁质脱乙酰酶5(HoCDA5)及其在不同组织中的表达情况,本研究利用RACE-PCR方法扩增获得编码华北大黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶的cDNA基因hocda5(GenBank登录号:ANI87833),该基因的开放阅读框为1140bp,编码379个氨基酸,属于第V类CDA蛋白。在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中成功表达约42kDa的蛋白,制备了HoCDA5蛋白的多克隆抗体并对其进行效价测定。利用western blot方法分析了HoCDA5蛋白在不同组织,不同发育时期的表达情况。结果表明:该蛋白主要分布于围食膜,中肠,并且在中肠的前部含量最高,在幼虫的粪便中也检测到了较大量的HoCDA5蛋白,推测华北大黑鳃金龟幼虫的围食膜为I型,HoCDA5可能随着围食膜的新陈代谢排出体外。本研究成功克隆和表达了HoCDA5重组蛋白,制备了多克隆抗体,对该蛋白进行了组织定位分析,为进一步明确HoCDA5蛋白的功能提供了理论依据。     

美国白蛾氨肽酶N的基因克隆表达及与苏云金杆菌3种毒素蛋白的结合特性分析

美国白蛾(Hyphantria cunea)是桑树的重要害虫。为明确苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白对该虫的作用机制,利用已知昆虫氨肽酶N基因序列设计引物,以美国白蛾中肠cDNA为模板,利用RACE-PCR技术获得美国白蛾中肠氨肽酶N基因hcapn1全长序列(GenBank登录号:KP053647)。该基因开放阅读框为3 000 bp,编码999个氨基酸,预测蛋白质的分子质量和等电点分别为113.14 kD和4.85。设计去信号肽引物PCR扩增获得hcapn1基因序列,构建原核重组表达载体pET30a-hcapn1,诱导表达的HcAPN1重组蛋白约110 kD。将苏云金杆菌Cry1Ac、Cry2Ab33和Cry9Ea6原毒素经胰蛋白酶消化后与HcAPN1重组蛋白分别进行体外配体印迹试验,发现HcAPN1重组蛋白与Cry9Ea6结合,而不与Cry2Ab33、Cry1Ac发生特异结合,推测HcAPN1可能为Cry9Ea6在美国白蛾中肠的受体蛋白。分别设计引物扩增HcAPN1蛋白2个结构域Asp₃₄～Asp_( 527)和Leu₅₆₃～Gln₉₂₅的编码序列,在大肠埃希菌中表达获得62 kD和48 kD 2种重组蛋白,体外结合试验显示Cry9Ea6与HcAPN1的结合发生在Leu₅₆₃～Gln₉₂₅之间。研究结果为深入理解苏云金杆菌Cry9Ea6蛋白对美国白蛾的杀虫机制提供了基础数据。     

基于CiteSpace对中草药防治奶牛乳房炎的研究趋势及热点的可视化分析

试验旨在探究中草药防治奶牛乳房炎的研究热点及趋势。试验运用CiteSpace软件对中草药防治奶牛乳房炎的相关文献从年发文量、文献来源及关键词进行可视化分析。结果显示，中草药防治奶牛乳房炎文献主要来源于黑龙江畜牧兽医、中国奶牛、动物医学进展等期刊，研究热点涉及抑菌试验、致病菌、药敏试验、耐药性分析、分离鉴定等领域，研究方法包括综述、系统评价、试验研究、临床治疗及安全性评价等。研究表明，中草药防治奶牛乳房炎的研究主要集中在畜牧科学、兽医科学及饲料与添加剂等领域，其中致病菌的分离鉴定与耐药性评价始终是研究的热点。     

美国白蛾几丁质脱乙酰酶的克隆、表达及酶学性质

【目的】研究美国白蛾(Hyphantria cunea)几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因的酶学性质,了解其在昆虫生命过程中如何发挥功能,为美国白蛾的生物防治提供新靶标。【方法】对家蚕(Bombyxmori)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和云杉卷夜蛾(Choristoneura fumiferana)3种鳞翅目昆虫的几丁质脱乙酰酶2序列保守域进行分析,采用同源比对方法,设计几丁质脱乙酰酶2基因特异引物,利用PCR扩增该基因全长c DNA序列;构建原核重组表达载体p ET30a-Hc CDA2,克隆获得编码美国白蛾Hc CDA2的基因,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测;构建重组杆状病毒表达载体p Fast Bac-Hc CDA1和p Fast Bac-Hc CDA2,脂质体转染法转染昆虫细胞Hi5,分别获得P1、P2、P3病毒,收集P3病毒上清,得到美国白蛾Hc CDA1(前期研究所得)和Hc CDA2重组蛋白,Western blot分析;重组蛋白Hc CDA1和Hc CDA2经硫酸铵粗纯化后,以对硝基乙酰苯胺为底物,测定重组几丁质脱乙酰酶Hc CDA12的酶活力,对其最适反应温度、最适p H以及金属离子的影响等酶学性质进行研究。【结果】获得了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因全长c DNA序列,命名为Hc CDA2(Gen Bank登录号:KT781841),基因全长1.6 kb,该基因在大肠杆菌中成功表达61 kD目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性多克隆抗体。Western blot分析结果表明,Hc CDA1和Hc CDA2在昆虫细胞(Hi5)中均成功表达约80 k D蛋白。酶学性质研究表明,昆虫细胞中分泌表达的Hc CDA1和Hc CDA2均具有催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,当温度达到80℃时,Hc CDA2几乎失去酶活力;Hc CDA1酶促反应适宜的p H范围为7.0—9.0,并且Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应的最适p H均为8.0;在最适反应条件下,Hc CDA2蛋白酶活力均高于Hc CDA1蛋白酶活力;Mg~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)和Ca~(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应整体呈抑制趋势,随浓度增大,Zn~(2)+对Hc CDA1抑制作用逐渐增强,而Mg~(2+)对Hc CDA1的抑制作用则呈现先升高后降低的趋势,而且Mg~(2+)和Ca~(2+)对Hc CDA2的抑制作用也是呈现先升高后降低的趋势。Co~(2+)和Fe~(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应有激活作用,随浓度增大,Fe~(2+)激活作用越强,而Co~(2+)激活作用则呈现先升高后降低的趋势。【结论】克隆了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因(Hc CDA2),在原核细胞中表达61 k D目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性抗体。得到具有活性的美国白蛾几丁质脱乙酰酶Hc CDA1和Hc CDA2,两者在体外均检测到催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,最适pH均为8.0。     

对甜菜夜蛾高杀虫毒力苏云金杆菌菌株的筛选及cry2Ah5的克隆表达

利用生物活性测定方法从本实验室已分离保存的Bt菌株中筛选出了5株对甜菜夜蛾具有较高杀虫毒力的菌株。该5株Bt菌株对甜菜夜蛾初孵幼虫的LC₅₀值为0.556~0.914mg/mL胞晶混合物,其中GS3菌株杀虫活性最高,LC₅₀值为0.556mg/mL胞晶混合物;包含晶体形态主要是球形、大菱形、小菱形等;所含基因类型主要是cry1Aa、cry1Ab、cry1La、cry1Ia、cry1Ib、cry2Ab、cry2Ad、cry2Ah、cry7Ab、cry9Ba等;5株菌株均表达约60kD和130~150kD蛋白,其中2株还表达较弱的80kD蛋白。从GS3菌株中克隆得到一种新的cry2A基因,GenBank登录号为KT692984,由Bt基因国际命名委员会命名为cry2Ah5。该基因开放阅读框为1899bp,编码632个氨基酸,编码蛋白分子量为70.8kD,等电点pI为8.18,与其他Cry2Ah蛋白序列相似性为97%~99%。该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达约70kD蛋白,与预测分子量相符。本研究筛选得到5株对甜菜夜蛾具有较高杀虫毒力的Bt菌株,克隆表达了一种新的cry2A基因cry2Ah5,为甜菜夜蛾的生物防治提供了新的菌株及基因资源。     

华北大黑鳃金龟丝氨酸羧肽酶在不同体系中的表达

丝氨酸羧肽酶（Serine carboxypeptidases,SCPs）是一类在酸性pH环境下参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节的真核生物蛋白水解酶。根据华北大黑鳃金龟丝氨酸羧肽酶（ HoSCP）全长基因序列设计引物,利用PCR方法克隆hoscp基因并分别连接到表达载体pET28b和pPIC9K上,转化大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115,实现了其在原核以及真核体系中的表达。结果显示,HoSCP在原核细胞及酵母细胞中均能稳定表达50 kDa的特异蛋白。 HoSCP的成功表达为其在华北大黑鳃金龟体内的活性和生物学功能研究提供了可能。     

Plackett-Burman结合Box-Behnken响应面法优化赪桐中类叶升麻苷纯化工艺及其稳定性分析

为优化赪桐中类叶升麻苷的纯化工艺，并分析其稳定性，试验对8种不同型号的大孔树脂进行吸附-解吸能力比较，筛选出最优的大孔树脂型号；采用Plackett-Burman结合Box-Behnken响应面法，考察上样液浓度、上样液流速、洗脱液浓度等因素水平，优化赪桐中类叶升麻苷的纯化工艺。通过高效液相测定纯化物在不同温度、光照、pH、抗氧化剂等环境条件下类叶升麻苷的含量。结果表明：赪桐中类叶升麻苷最佳纯化工艺条件为ADS-7型号大孔吸附树脂、上样液浓度9.0 mg/mL、上样液流速3.0 m L/min、洗脱液浓度58%，验证试验中的类叶升麻苷回收率可达到76.04%，与所建模型预测接近；稳定性试验表明，温度越高、光照时间越久、pH越高、类叶升麻苷的稳定性越差。同时，添加抗氧化剂可以明显增强其稳定性。故纯化后的类叶升麻苷应在低温、避光、酸性环境中贮藏和使用，且可通过添加不同种抗氧化剂延长其使用期限。采用Plackett-Burman结合Box-Behnken响应面法优化赪桐中类叶升麻苷纯化工艺稳定可行，可为后续抗奶牛乳房炎中草药型饲料添加剂产品的研发及产品稳定性使用提供理论依据。     

基于网络药理学探究赪桐潜在抗奶牛乳房炎的作用机制

为了探究赪桐潜在防治奶牛乳房炎的作用机制,试验基于网络药理学,利用TCMSP数据库收集赪桐潜在抗奶牛乳房炎致病菌活性成分,在GeneCards数据库中收集与奶牛乳房炎致病菌相关的作用靶点。利用Cytoscape 3.8.2软件绘制赪桐活性成分与致病菌靶点网络图,通过将筛选到的致病菌靶点导入STRING数据库构建致病菌靶点相互作用网络,最后利用DAVID、Metascape数据库对各靶点进行GO功能注释和KEGG富集分析。结果表明:共得到赪桐潜在抗奶牛乳房炎活性成分11个,对应致病菌靶点86个;共得到97个节点,174条相互作用关系;去除游离的病菌靶点后,最终得到31个关键作用靶点。GO功能注释得到312条基因数量较大的功能注释,主要涉及细胞膜、原子核、蛋白质结合、基于转录正向调控过程、信号转导过程等。KEGG富集分析主要涉及蛋白结合通路、酶结合通路、ATP结合通路等。说明基于网络药理学预测,赪桐可通过多种活性成分作用于不同靶点,并通过调控炎症反应、氧化还原反应等过程达到防治奶牛乳房炎的目的。