肝癌细胞靶向肽的筛选与鉴定

利用噬菌体环七肽库筛选与肝癌细胞特异性结合的多肽,并对其亲和力进行生物学鉴定。以HL-7702为消减细胞,HepG2为筛选靶细胞,对噬菌体随机环七肽库进行4轮全细胞消减筛选,并随机挑取60个阳性噬菌体克隆,以ELISA法鉴定其与HepG2细胞的结合活性,并取阳性克隆进行测序分析,并合成多肽进行免疫细胞化学染色鉴定。经4轮筛选,噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集;利用ELISA从随机挑选的60个噬菌体克隆中得到15个与肝癌细胞具有高结合力的阳性克隆,测序并进行序列分析比对发现氨基酸序列无同源性,经免疫细胞化学染色鉴定后,发现1条多肽序列亲和力较高,为提高抗菌肽对肿瘤细胞的靶向杀伤作用奠定基础。     

猪Gasp1和Gasp2基因对C2C12细胞分化的影响

为研究猪Gasp1、Gasp2对成肌细胞分化的影响,采用RT-PCR技术从猪肌肉组织中扩增Gasp1和Gasp2基因片段,将其克隆入phi C31载体,构建重组质粒phi C31-Gasp1和phi C31-Gasp2。将重组质粒转染至C2C12小鼠成肌细胞,经嘌呤霉素筛选在荧光显微镜下观察,获得稳定表达Gasp1和Gasp2基因的细胞系后,应用CCK-8法检测细胞增殖能力。分别在细胞分化1、2、3、4、5 d时收集细胞,采用实时荧光定量PCR检测MyoD、MyoG、P21及MHC肌细胞分化相关基因的表达变化,进而分析Gasp1和Gasp2基因对肌肉分化的影响。结果显示,成功克隆了猪Gasp1和Gasp2基因,构建了phi C31-Gasp1和phi C31-Gasp2重组质粒,荧光显微镜下可见phi C31载体和Gasp1、Gasp2基因共转染的C2C12细胞表达强烈的绿色荧光,经CCK-8检测发现,过表达Gasp1、Gasp2基因对细胞的生长增殖影响为初期促进、后期抑制;实时荧光定量PCR检测结果表明,猪Gasp1和Gasp2可以促进细胞分化因子MyoD、MyoG、P21、MHC基因的表达。以上结果表明,Gasp1、Gasp2基因可以促进肌肉分化。     

猴源cathepsin基因shRNA文库及其稳定敲减细胞系的构建

目前关于组织蛋白酶(cathepsin)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)生活周期中发挥功能的研究较少。为了探究宿主细胞中cathepsin在PRRSV吸附、入侵、脱壳、生物合成、组装以及释放过程中的作用,选取源于MA-104的非洲绿猴胚胎肾上皮细胞Marc145细胞系(对PRRSV易感);利用RNAi原理,构建了以pLKO.1为载体的cathepsin基因shRNA文库;并用puromycin筛选出稳定敲减cathepsin的细胞株。结果显示:本试验构建的cathepsin-shRNA文库包含45个克隆,涉及15种cathepsin基因,筛选出的稳定细胞株中相应cathepsin基因mRNA的表达量均有显著下降。这些细胞株的构建为进一步研究cathepsin在PRRSV生活周期中发挥的重要功能奠定了基础。     

NDM-1肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体的分离鉴定及其对小鼠菌血症的治疗研究

噬茵体疗法在对抗多重耐药病原茵引起的感染方面具有很大的应用潜力。本研究从污水中分离到一株新的噬茵体,命名为NKP-1,并对噬茵体NKP-1的主要生物学特性进行研究。通过电镜观察确定NKP-1为短尾噬茵体,裂解试验表明该噬茵体为烈性噬茵体,具有很高的增值效率。体外试验表明它能够快速感染超强耐药的肺炎克雷伯菌株BAA-2146(NDM-1)并将其裂解。通过腹腔注射单一剂量的NKP-1(2×10~7 pfu/mL)就可以有效地保护BAA-2146(4×10~9 cfu/mL)感染引起的小鼠茵血症模型。在肺炎克雷伯菌BAA-2146与噬菌体NKP-1体外共同培养的过程中,我们分离到对该噬茵体具有抗性的突变菌株,通过动物试验确定该突变株表现为极低的毒力,且不影响NKP-1的治疗效果。本研究为利用噬菌体治疗多重耐药菌感染提供了理论基础与试验依据。     

PK-15细胞敲除TANK结合激酶1基因促进猪伪狂犬病病毒复制的研究

TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响。然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Westernblot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响。结果显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制。RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRVmRNA转录和蛋白表达。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为10^6.8TCID50·0.1mL^-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为10^8.5TCID50·0.1mL^-1。另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调。以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关。