棘阿米巴原虫actin1基因原核表达载体构建与鉴定

棘阿米巴角膜炎的临床诊断比较困难,以角膜刮片的病原学诊断为主,样本采集困难,临床诊断率低。本研究构建了棘阿米巴原虫actin1基因进行原核表达载体,并进行鉴定。以棘阿米巴滋养体cDNA为模板,通过特异性引物,经聚合酶链反应,获得actin1基因开放阅读框(ORF)片段,进行克隆及序列分析,经双酶切,连接,构建重组表达载体pET22b(+)-actin1。将重组载体转化入大肠杆菌(E.coli)DH5α,筛选出阳性菌落,经PCR扩增和酶切鉴定后,阳性质粒送样测序;提取阳性质粒,转化入E.coli BL21(DE+),1mol/L IPTG诱导重组蛋白r-actin1的表达。自棘阿米巴滋养体cDNA扩增得到约774bp的actin1基因片段;经PCR和酶切鉴定表明,重组表达载体pET22b(+)-actin1构建成功;重组菌株BL21(DE+)/pET22b(+)-actin1,经培养、诱导、SDS-PAGE电泳,出现1条相对分子质量约为30 000重组蛋白条带,r-actin1表达诱导表达成功。成功构建重组表达载体pET22b(+)-actin1,并诱导表达。     

棘阿米巴表达文库的免疫学筛选

通过棘阿米巴感染兔血清对棘阿米巴原虫全长cDNA文库进行免疫学筛选,采用角膜注射的方法构建棘阿米巴感染兔模型,收集感染后第1、7、14、21、28、35、42天兔血清,ELISA法测定抗体滴度;选用感染后第7、14、21天和28天混合血清对c DNA文库进行免疫学初筛和复筛;阳性克隆送样测序,并进行PCR鉴定和序列分析。结果:角膜刮片镜检,感染动物试验组均检出棘阿米巴的包囊和滋养体,感染血清抗体滴度在感染后第7天升高显著,在感染后第28天达到高峰;经免疫学筛选共获得3个阳性克隆,经测序和PCR鉴定,3个克隆的插入序列和ORF长度分别为:actin1,774 bp、polyubiquitin,234 bp和HSP20,564 bp。本研究为进一步棘阿米巴原虫感染的快速诊断试剂和免疫预防分子的筛选奠定基础。     

去甲斑蝥素抑制肺癌细胞增殖的体外研究

为分析去甲基斑蝥素二钠盐对人和小鼠肺癌细胞增殖的抑制作用,体外培养人非小细胞肺癌A549细胞和小鼠肺癌Lewis细胞,用WST-1还原法检测不同浓度去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)对肿瘤细胞增殖的抑制作用,并用流式细胞术分析细胞周期;免疫印迹技术分析MAPK激酶表达。NCTD抑制A549和Lewis增殖的IC50值分别为13.5和9.5μmol/L;0、6.25、12.50和25.00μmol/L NCTD处理24h,诱导A549细胞G2/M期阻滞率分别为26.30%、29.44%、49.83%和81.35%。结果表明,抑制肿瘤细胞增殖可能是去甲基斑蝥素抗肿瘤作用的分子机制之一。